山西老陳醋發(fā)酵階段高產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的篩選與鑒定

喬 羽,于 迪,邢曉瑩,范振宇,王如福*

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山西 晉中 030801)

淀粉酶是催化淀粉、糖原、糊精中糖苷鍵水解的一類酶的統(tǒng)稱,廣泛用于食品加工、釀造、制藥、紡織、飼料等領(lǐng)域[1]。淀粉酶廣泛存在于自然界多種生物體中,其中微生物淀粉酶來(lái)源非常廣泛,如真菌中的米曲酶和黑曲霉,細(xì)菌中的枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等[2-3]。

山西老陳醋歷史悠久,是我國(guó)傳統(tǒng)的四大名醋之一,它以高粱為主要原料,以麩皮、谷糠和稻殼為輔料,利用大曲作為糖化發(fā)酵劑,經(jīng)酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵等工序釀制而成。其釀造過(guò)程從微生物的角度看,實(shí)質(zhì)上是一個(gè)特定的微生物群體共代謝的過(guò)程[4]。除了起主要發(fā)酵作用的酵母菌、乳酸菌和醋酸菌,芽孢桿菌在大曲和整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中始終存在。目前有研究報(bào)道,在大曲制作的最后階段,芽孢桿菌成為占主導(dǎo)地位的菌群之一,這可能是由于其極強(qiáng)的抗逆性[5-7]。此外有研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌在醋酸發(fā)酵階段芽抱桿菌的活動(dòng)規(guī)律及其數(shù)量變化曲線同醋酸菌基本一致,呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì),且它與醋酸菌協(xié)同參與發(fā)酵,對(duì)食醋酸度、風(fēng)味形成具有一定的促進(jìn)作用[8-9]。

芽孢桿菌代謝可產(chǎn)生淀粉酶,發(fā)酵過(guò)程中淀粉酶總活力的高低決定了老陳醋發(fā)酵過(guò)程中原輔料中淀粉的轉(zhuǎn)化效率,進(jìn)而影響最終醋的產(chǎn)量。因此在老陳醋發(fā)酵過(guò)程中,如果能對(duì)產(chǎn)淀粉酶芽孢菌合理的應(yīng)用,則可能提高對(duì)淀粉原料的分解利用,進(jìn)而提高出醋率,同時(shí)也能在一定程度上改善產(chǎn)品風(fēng)味。本研究跟蹤山西老陳醋的整個(gè)發(fā)酵過(guò)程,從不同發(fā)酵天數(shù)的酒醪和醋醅中篩選產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌。通過(guò)對(duì)產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的初篩、酶活力測(cè)定及耐受性分析,篩選高產(chǎn)淀粉酶且耐受性較好的優(yōu)勢(shì)芽孢桿菌,以期為后期高淀粉酶活力復(fù)合菌劑的研制提供菌種基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)樣品

樣品取自山西某醋廠。酒醪發(fā)酵時(shí)間為1 d、4 d、7 d、10 d；醋醅發(fā)酵時(shí)間為1 d、3 d、5 d、7 d、9 d。每個(gè)樣品3份,置于4℃冰箱保存,備用。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒:北京艾德萊生物科技有限公司；D2000 DNA Ladder、2×Taq聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)Master Mix:中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；碘、碘化鉀、蔗糖(分析純):天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；鹽酸四甲基對(duì)苯二胺:東京化成工業(yè)株式會(huì)社；無(wú)水葡萄糖(分析純):天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；可溶性淀粉(分析純):天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、瓊脂15 g,定容至1 000 mL,121℃滅菌15 min,備用。

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g,定容至1 000 mL,121℃滅菌15 min,備用。

初篩培養(yǎng)基[10]:可溶性淀粉2 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、瓊脂粉18g、氯化鈉5g,定容至1000mL,121℃滅菌20min,備用。

改良發(fā)酵培養(yǎng)基[11]:高粱粉5 g、可溶性淀粉5 g、酵母膏5 g、蛋白胨10 g、葡萄糖1 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 0.5g、CaCl2·2H2O0.2g,定容至1000mL,121℃滅菌20min,備用。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-100B-Z生化培養(yǎng)箱:北京瑞科中儀科技有限公司；Neofuge 23R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī):上海力申科學(xué)儀器有限公司；2100型分光光度計(jì):大尼科(上海)儀器有限公司；LEICA CM750生物顯微鏡:德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)有限公司；ZQPL-200立式全溫振蕩培養(yǎng)箱:天津萊玻特瑞設(shè)備有限公司；Centrifuge 5424R低速冷凍離心機(jī):德國(guó)Eppendorf公司；DYY-6C型電泳儀:北京市六一儀器廠；凝膠成像分析系統(tǒng):美國(guó)UVP公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的菌落數(shù)量測(cè)定

稱取10g不同發(fā)酵天數(shù)的酒醪、醋醅樣品置于裝有90mL無(wú)菌水的三角瓶中,80℃水浴加熱10 min富集芽孢菌,對(duì)富集液進(jìn)行10倍梯度稀釋；吸取100 μL不同稀釋倍數(shù)的菌懸液涂布至初篩培養(yǎng)基上,每個(gè)梯度做三個(gè)平行；30℃恒溫培養(yǎng)48 h后,加入一定量的盧氏碘液,染色5 min,選擇菌落數(shù)量在15～300的平板,記錄有明顯透明圈菌落的個(gè)數(shù)。

1.3.2 產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的初篩

選擇有明顯透明圈單個(gè)菌落,采用分區(qū)劃線法連續(xù)純化3代后,固體斜面4℃保存?zhèn)溆谩⒁鸭兓难挎邨U菌再次點(diǎn)接于初篩培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)48 h后,滴加盧氏碘液,使其均勻覆蓋平板,用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量水解圈直徑(D1)和菌落直徑(D2),計(jì)算兩者比值(D1/D2)大小,初步確定淀粉酶活力的高低并挑選出比值較大的菌株。

1.3.3 菌株復(fù)篩

經(jīng)初篩純化后的菌株挑取一環(huán)接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,30℃搖床培養(yǎng)24h。按照2%接種量接種于裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中,37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液置于50 mL的離心管中,8 000 r/min離心10 min,收集上清液為待測(cè)粗酶液。采用3,5-二硝基水楊酸法(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)測(cè)定待測(cè)粗酶液的淀粉酶活力,具體方法參考文獻(xiàn)[12-13]。酶活力單位定義:在40℃、pH值為3.7的條件下,每毫升酶液每分鐘水解可溶性淀粉產(chǎn)生1 μg葡萄糖為1個(gè)酶活力單位(U/mL)。

1.3.4 高產(chǎn)淀粉酶菌株的耐受性分析

耐乙醇能力分析:用接種環(huán)挑取一環(huán)菌接種于裝有10 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的試管中,37℃、220 r/min搖床培養(yǎng)18 h,然后按2%的接種量接種于裝有10 mL乙醇體積分?jǐn)?shù)(V/V)分別為3%、6%、9%的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,37℃、220 r/min搖床培養(yǎng)培養(yǎng)24 h,用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm條件下測(cè)定培養(yǎng)液的吸光度值。

耐酸能力分析:用接種環(huán)挑取一環(huán)菌接種于裝有10mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的試管中,37℃、220 r/min搖床培養(yǎng)18 h,按2%的接種量分別接種于裝有10 mL用乙酸調(diào)節(jié)pH分別為3.5、4.5、5.5的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)培養(yǎng)24 h,用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定培養(yǎng)液的吸光度值。

不同溫度的生長(zhǎng)情況分析:用接種環(huán)挑取一環(huán)菌于裝有10 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的試管中,37℃,220 r/min搖床培養(yǎng)18 h后,按2%的接種量接種于裝有10 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,分別在20℃、30℃、40℃、50℃培養(yǎng)溫度下,220 r/min搖床培養(yǎng)24 h,用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定培養(yǎng)液的吸光度值。

1.3.5 高產(chǎn)淀粉酶菌株的鑒定

(1)形態(tài)學(xué)鑒定:將菌株劃線涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上,于37℃培養(yǎng)24h,觀察菌落特征并描述。挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色對(duì)菌株的細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。

(2)生理生化鑒定:參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第8版中芽孢桿菌屬特征和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[14-15]進(jìn)行部分生理生化特性鑒定。

(3)分子生物學(xué)鑒定:采用16S rDNA鑒定,利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對(duì)菌株的基因組DNA進(jìn)行提取,采用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F和1492R為上下游引物,以菌株的DNA基因組為模板,PCR擴(kuò)增菌株16S rDNA的部分基因序列。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s,53℃退火30 s,72℃延伸1.2 min,30次循環(huán)；72℃延伸7min。取4μL的PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,檢測(cè)是否擴(kuò)增成功。將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì),下載同源性高的序列,利用Mega 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 山西老陳醋發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的動(dòng)態(tài)變化

圖1 發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的菌落數(shù)量變化曲線Fig.1 Change curve of the colony number of amylase-producing Bacillusduring fermentation

由圖1可知,山西老陳醋發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌的菌落數(shù)量呈現(xiàn)先下降后上升然后下降的趨勢(shì)。在酒化階段,隨著發(fā)酵時(shí)間的推移,由于酒醪中酒精度的增加以及后期相對(duì)無(wú)氧的發(fā)酵環(huán)境,抑制了芽孢桿菌的生長(zhǎng),所以產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的數(shù)量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),在酒化最后一天其數(shù)量達(dá)到最低為4.0×104CFU/g。在醋化階段,隨著輔料加入稀釋了醋醅中的酒精濃度,并且醋醅處在一個(gè)開(kāi)放的環(huán)境,產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌的數(shù)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在醋酸發(fā)酵第3天達(dá)到最大為1.1×105CFU/g。隨后由于隨著醋醅中酸的逐漸積累,芽孢桿菌的數(shù)量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),在醋酸發(fā)酵最后一天降至最低為3.3×104CFU/g。

2.2 產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌初篩

從醋廠采集的不同發(fā)酵天數(shù)的酒醪和醋醅9份樣品中,分離純化得到60株產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌。水解圈直徑(D1)、菌落生長(zhǎng)直徑(D2)及其比值是表征菌株產(chǎn)酶能力高低的一個(gè)指標(biāo)[16]。通過(guò)計(jì)算透明圈和菌落生長(zhǎng)直徑的比值,挑選出比值＞4.5的16株芽孢桿菌。由表1可知,菌株JT10-9、CT32-3、CT73-6的D1/D2值都超過(guò)了9。說(shuō)明其產(chǎn)淀粉酶的能力相對(duì)較高。

表1 產(chǎn)淀粉酶菌株初步篩選Table 1 Preliminary screening of amylase-producing strains

2.3 淀粉酶活力的測(cè)定

對(duì)挑選出來(lái)的16株產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng),對(duì)菌株粗酶液的淀粉酶活力進(jìn)行測(cè)定。經(jīng)發(fā)酵復(fù)篩,用軟件Prism作柱形圖并進(jìn)行顯著性差異分析。復(fù)篩結(jié)果如圖2所示,16株芽孢桿菌的粗酶液在40℃、pH值為3.7的條件下,均有一定分解淀粉的能力,說(shuō)明所選菌株具有產(chǎn)淀粉酶的能力。利用Prism對(duì)菌株淀粉酶活力大小進(jìn)行顯著性分析可知,菌株JT10-9、JT 10-8、JT1-3、JT4-4、CT32-3和CT73-6的淀粉酶活力都高于180 U/mL,并顯著高于大部分菌株(P＜0.05),其中菌株JT10-9的淀粉酶活力最高,達(dá)到228.73 U/mL。選取菌株JT10-9、JT 10-8、JT1-3、JT4-4、CT32-3和CT73-6進(jìn)行下一步耐受性試驗(yàn)分析。

圖2 分離菌株的淀粉酶活力Fig.2 Amylase activity of the isolated strains

2.4 產(chǎn)淀粉酶菌株的耐受性分析

2.4.1 耐乙醇能力分析

圖3 產(chǎn)淀粉酶菌株的在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Fig.3 Growth status of amylase-producing strains at mediums with different ethanol concentrations

根據(jù)山西老陳醋實(shí)際生產(chǎn)情況可知,山西老陳醋酒化階段初期(0～2d)酒醪的乙醇體積分?jǐn)?shù)能夠由0快速升高到6%左右,酒化結(jié)束時(shí)酒醪的乙醇體積分?jǐn)?shù)能夠達(dá)到9%[17]。通過(guò)測(cè)定菌株培養(yǎng)液的光密度值,可反映菌株在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的環(huán)境中的生長(zhǎng)情況,進(jìn)而可推斷菌株是否能應(yīng)用在實(shí)際的生產(chǎn)環(huán)境中。由圖3可知,菌株JT10-9、JT10-8、JT1-3、JT4-4、CT32-3、CT73-6在乙醇體積分?jǐn)?shù)為3%的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)升高至6%時(shí),所有菌株培養(yǎng)液的OD600nm值都有所下降。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)升高至9%,所有菌株培養(yǎng)液的OD600nm值下降明顯,但是菌株在乙醇體積分?jǐn)?shù)為9%的環(huán)境中都能有所生長(zhǎng)。因此,分離得到的6株產(chǎn)淀粉酶菌株均可耐受體積分?jǐn)?shù)9%的乙醇,其中菌株JT10-9耐乙醇能力較強(qiáng)。

2.4.2 耐酸能力分析

圖4 產(chǎn)淀粉酶菌株在不同pH培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Fig.4 Growth status of amylase-producing strains at mediums with different pH

根據(jù)山西老陳醋實(shí)際生產(chǎn)情況及本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)發(fā)酵過(guò)程中pH變化測(cè)定結(jié)果,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH,考察菌株在pH 3.5～5.5環(huán)境中的生長(zhǎng)狀況,結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知,各菌株在pH5.5的環(huán)境中生長(zhǎng)較好。隨著pH的降低至3.5時(shí),產(chǎn)淀粉酶菌株的生長(zhǎng)情況受到不同程度的抑制。菌株JT10-8和菌株JT1-3的OD600nm值降到了0.1以下,幾乎停止生長(zhǎng)。菌株JT10-9、CT32-3、CT73-6的生長(zhǎng)雖然受到抑制,但均能在pH3.5的環(huán)境中生長(zhǎng)。說(shuō)明菌株JT10-9、CT32-3和CT73-6的耐酸能力較好。

2.4.3 溫度耐受能力分析

圖5 產(chǎn)淀粉酶菌株不同培養(yǎng)溫度下的生長(zhǎng)情況Fig.5 Growth status of amylase-producing strains at different culture temperatures

根據(jù)山西老陳醋實(shí)際生產(chǎn)情況,選取在20℃、30℃、40℃和50℃溫度下培養(yǎng)高產(chǎn)淀粉酶的菌株,考察溫度對(duì)產(chǎn)淀粉酶菌株生長(zhǎng)狀況的影響,結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知,高產(chǎn)淀粉酶菌株均在30℃條件下生長(zhǎng)良好,在此溫度下所有菌株的OD600nm值達(dá)到最大,30℃條件下各菌株的生長(zhǎng)量遠(yuǎn)高于其它培養(yǎng)溫度下的生長(zhǎng)量。在40℃條件下,各菌株的OD600nm值高于20℃條件下的OD600nm值,并且顯著高于50℃條件下的OD600nm值。說(shuō)明菌株在30～40℃環(huán)境中可以較好的生長(zhǎng)。在50℃條件下,菌株CT73-6幾乎停止生長(zhǎng),說(shuō)明其耐高溫能力較差。其他5株菌都可在50℃條件下的環(huán)境中生長(zhǎng),說(shuō)明菌株JT10-9、JT10-8、JT1-3、JT4-4、CT32-3能夠適應(yīng)大曲制作及山西老陳醋生產(chǎn)的環(huán)境。

2.5 菌株個(gè)體及菌落形態(tài)觀察結(jié)果

綜合所篩選菌株的耐受性分析可知,菌株JT10-9可完全適應(yīng)山西老陳醋的發(fā)酵環(huán)境,所以對(duì)菌株JT10-9進(jìn)行了個(gè)體形態(tài)和菌落形態(tài)的觀察,結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知,菌株JT10-9的菌體形態(tài)為桿狀,革蘭氏染色陽(yáng)性,芽孢中生,孢囊不膨大。菌落直徑為2.20～3.10 mm,呈乳白色,不透明,隆起,邊緣不規(guī)則。

圖6 菌株JT10-9的細(xì)胞形態(tài)(A)及菌落特征(B)Fig.6 Cell morphology(A)and colony characteristics(B)of strain JT10-9

2.6 生理生化特性鑒定

菌株JT10-9菌株的生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知,菌株JT10-9的生理生化特征與《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中芽孢桿菌屬特征相符,進(jìn)一步確定菌株JT10-9屬于芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。

表2 菌株JT10-9的生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical identification results of strain JT10-9

2.7 菌株16SrDNA鑒定結(jié)果

以菌株JT10-9基因組DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,如圖7所示,菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)出在大約1500bp處存在一條特異性條帶。獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序?yàn)?416 bp長(zhǎng)度的序列。測(cè)序結(jié)果輸入到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)Blast比對(duì)進(jìn)行同源性比較。利用Mega 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)果如圖8所示。由圖8可知,菌株JT10-9在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上與Bacillus amyloliquefaciens同屬于一個(gè)分支,通過(guò)Blast比對(duì)該菌株序列與已知多株Bacillus amyloliquefaciens16S rDNA的同源性高達(dá)99%以上。因此,結(jié)合菌株JT10-9的菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、生理生化鑒定結(jié)果,初步確定菌株JT10-9為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

圖7 菌株JT10-9基因的16S rDNA擴(kuò)增PCR電泳結(jié)果Fig.7 Electrophoretic results of PCR amplification of 16S rDNA of strain JT10-9 gene

圖8 菌株JT10-9的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.8 Phylogenetic tree of strain JT10-9

2.8 討論

本試驗(yàn)從山西老陳醋的不同發(fā)酵天數(shù)的酒醪和醋醅中分離產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌,初篩采用的水解圈法,雖易于直觀的分離出淀粉酶產(chǎn)生菌,但初篩結(jié)果可能會(huì)受到平板pH、平板厚度不均一等因素的影響,水解圈法不能準(zhǔn)確判斷菌株的淀粉酶活力的大小,所以采用DNS法對(duì)菌株的淀粉酶活力進(jìn)一步的測(cè)定。本研究是在40℃,pH 3.7條件下測(cè)得菌株JT10-9的淀粉酶酶活力為228.73 U/mL,其作為野生土著細(xì)菌菌株,在酸性的條件下表現(xiàn)出的淀粉酶活力還是比較高的,而且芽孢桿菌能克服霉菌發(fā)酵中產(chǎn)生帶顏色的菌絲和孢子的缺點(diǎn)[13]。接下來(lái)可針對(duì)該菌株的酶學(xué)特性做進(jìn)一步的研究分析。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)山西老陳醋酒化階段和醋化階段產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌進(jìn)行了分離篩選,得一株淀粉酶活力較高且耐受性較好的菌株JT10-9。對(duì)菌株JT10-9的菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、生理生化鑒定以及16S rDNA鑒定,最后鑒定出菌株JT10-9為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。后期可采用生物技術(shù)手段對(duì)BacillusamyloliquefaciensJT10-9進(jìn)行定向改造,以提高其在酸性條件下的淀粉酶活力。從而將其用于強(qiáng)化酒化發(fā)酵和醋化發(fā)酵以及酶制劑的研制,這對(duì)提高淀粉質(zhì)原料的分解利用及耐酸型淀粉酶制劑的開(kāi)發(fā)具有良好的應(yīng)用前景。

[1]PANDEY A,NIGAM P,SOCCOL C R,et al.Advances in microbial amylases[J].Biotechnol Appl Biochem,2000,31(2):135.

[2]劉杰雄,陳 號(hào),陸 雯,等.淀粉酶高產(chǎn)菌株的篩選及其酶活的測(cè)定[J].食品工程,2010(1):45-47.

[3]劉 欣.食品酶學(xué)[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,2006:35-40.

[4]呂艷歌,馬海樂(lè),李云亮,等.山西老陳醋產(chǎn)酸菌的分離鑒定及系統(tǒng)分析[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2013,13(12):163-171.

[5]ZHENG X W,YAN Z,HAN B Z,et al.Complex microbiota of a Chinese"Fen"liquor fermentation starter(Fen-Daqu),revealed by culture-dependent and culture-independent methods[J].Food Microbiol,2012,31(2):293-300.

[6]NIE Z Q,ZHENG Y,DU H F,et al.Dynamics and diversity of microbial community succession in traditional fermentation of Shanxi aged vinegar[J].Food Microbiol,2015,47:62-68.

[7]王進(jìn)龍.山西老陳醋大曲中芽孢桿菌的分離鑒定及特性研究[D].晉中:山西農(nóng)業(yè)大學(xué),2016.

[8]弓曉艷.老陳醋釀造過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)與功能研究[D].太原:山西大學(xué),2010.

[9]趙洪源.涼州熏醋傳統(tǒng)釀造過(guò)程高產(chǎn)四甲基吡嗪微生物篩選及其代謝機(jī)理初探[D].蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2015.

[10]魯 珍,魏姜勉,諶馥佳,等.高溫大曲中高產(chǎn)α-淀粉酶菌株分離鑒定及其產(chǎn)酶性能研究[J].農(nóng)業(yè)研究與應(yīng)用,2016(2):5-11.

[11]李 力,劉冬梅,羅淑萍,等.高淀粉酶蛋白酶活力枯草芽孢桿菌菌株的篩選及鑒定[J].漁業(yè)現(xiàn)代化,2008,35(2):15-18.

[12]賴玉城.產(chǎn)多酶體系混菌固態(tài)發(fā)酵酒糟生產(chǎn)蛋白飼料[D].福州:福建師范大學(xué),2014.

[13]張 琳,張 也,王如福,等.大曲中高產(chǎn)糖化酶菌株的篩選及環(huán)境耐受性分析[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2016,36(10):740-744.

[14]布坎南,R.F.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,1984:15-19.

[15]蔡妙英,東秀珠.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2001:25-28.

[16]馮瑞章,龐建義,王 濤,等.濃香型白酒產(chǎn)糖化酶菌株篩選及產(chǎn)酶條件研究[J].中國(guó)釀造,2013,32(10):81-84.

[17]吳光明,楊林娥,張 磊,等.山西老陳醋生產(chǎn)過(guò)程中酒精度變化規(guī)律研究[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(4):450-451.