內生真菌苦馬豆素生物合成研究進展

薩如拉 盧萍

摘要：指出了苦馬豆素（Swainsonine，SW）是一種有毒的吲哚里茲啶生物堿，含有sw的棘豆屬和黃芪屬植物統稱為瘋草，牲畜過量采食瘋草中毒.引起畜牧業的巨大損失。SW具有抗腫瘤和免疫調節的醫學作用.但人工合成sw價格較高，因此利用生物合成SW也有重要價值。從sw來源及理化性質、作用機理、提取檢測方法，瘋草內生真菌SW及其生物合成途徑研究進展等方面進行綜述，為明晰SW合成途徑、控制瘋草蔓延及發揮SW的醫療作用提供參考。

關鍵詞：瘋草內生真菌;苦馬豆素;生物合成

中圖分類號：0629.3

文獻標識碼：A

文章編號：1674-9944（2018）8-0227-03

1 引言

瘋草（locoweeed）是含苦馬豆素（Swainsonine，SW）的棘豆屬（Oxytropis glabra DC.）和黃芪屬（Asr.ragalus）有毒植物的統稱[1]。SW是一種吲哚茲定生物堿，抑制動物細胞a-甘露糖苷酶和高爾基體甘露糖苷酶Ⅱ的活性[2]，引起低聚糖代謝和糖蛋白合成障礙，導致細胞和組織器官功能紊亂。家畜過量采食含有SW的瘋草發生中毒，出現四肢麻痹、食欲不振、體重減少、流產等，嚴重者死亡，為畜牧業帶來了極大的經濟損失[3～5]。近年來對瘋草內生真菌SW的研究越來越深入，已經初步研究出sw在植物和瘋草內生真菌中的合成機制，推測出sW合成部分途徑，其詳細未知。SW有良好的抗腫瘤和免疫調節活性，利用真菌合成有望提高SW的提取率[6]。

2 SW的性質、作用機理及提取檢測

2.1 SW來源及其理化性質

1979年Colegate等首次從灰苦馬豆中分離出有毒的三羥基吲哚茲定生物堿— SW[3]，SW化學式為C8H15NO3，分子量為173，熔點144℃～145℃，pKa為7.4，其純品為白色針狀晶體，易溶于水.不溶于乙醚、氯仿、和丙酮等有機溶劑。1982年美國學者Molyneux從美國瘋草中分離得到sw，認為在美國牲畜瘋草中毒主要由SW引起[7]。1989年我國學者曹光榮從黃花棘豆中分離得到SW[8]，2003年Braun等從美國斑莢膜黃芪（Astragalus mollissimus）、藍伯氏棘豆（Oxytropis Lambertii）和絹毛棘聶（Oxytropis sericea）三種瘋草中培養出埃里磚格孢屬內生真菌（ Embellisia sp. L12，），并從該內生真菌中分離出SW[9]，盧萍等從小花棘豆（ Oxytropis glabra））、刺葉柄棘豆（Oxytropis aciphylla）和砂珍棘豆（Oxytropis racemosa）單株植物巾提取sw，發現只有小花棘豆含SW，并植株體外分離得到內生真菌，通過微生物學特征和5. 8SrDNA/ITS序列測序鑒定該內生真菌為Embellisia，后修訂為Alternaria，而不含SW的小花棘豆都沒有內生真菌，體內有內生真菌的小花棘豆產牛SW，提出小花棘豆的SW由內生真菌合成[10，11]。此外，余永濤、王建華、路浩等從甘肅棘豆、冰川棘豆、莖直黃芪、青海瘋草中分離出了SW。

另外，Schneider等從豆類絲核菌、Hino等從金龜子綠僵菌中也分離到sw。

2.2

SW的機理

sw引起動物瘋草病，它特異性抑制細胞溶酶體？一甘露糖苷酶和高爾基體甘露糖苷酶Ⅱ的活性，使甘露糖苷酶與甘露糖的結合受阻，甘露糖蛋白代謝異常，引起神經細胞的功能的紊亂，導致細胞空泡化，從而牲畜出現巾毒癥狀，主要對牲畜巾樞神經系統、內臟及骨骼肌等組織細胞造成嚴重損傷，牲畜中毒給草原畜牧業帶來重大損失[3～5]。

SW有抗腫瘤活性，能抑制腫瘤細胞的生長和轉移，并提高機體免疫功能，使NK細胞和LAK細胞對腫瘤細胞的殺傷能力顯著增強[6]。

2.3 SW的提取和檢測方法

1979年Colegate等利用乙酸乙酯索氏提取法首次提取到SW，溶液經陽離子交換柱層析，用氨水洗脫，收集濃縮后用氯化鈉梯度洗脫，氨水一氯仿抽提，回收后重結晶后得SW[3]。我國學者曹光榮從黃花棘豆中分離到SW，用鹽酸浸泡植物樣品粉末，濾液過離子交換柱層析，洗脫得sw[8]。盧萍等從小花棘豆內生真菌中提取，利用乙酸一氯仿萃取、陽離子交換層析純化得sw。目前檢測SW方法主要有薄層色譜法、氣相色譜法及氣相色譜一質譜聯用法、液相色譜法及液相色譜一質譜聯用法、α-甘露糖苷酶活性抑制分析法等。

薄層色譜技術用于快速分離和定性分析未知化合物。SW是三羥基生物堿，對常規生物堿顯色劑反應不靈敏、不易觀察其顏色，可用Erilich's試劑顯色法，將檢測樣品氧化后用醋酸酐處理加熱發生脫水反應，形成不飽和鍵，與Erilich's試劑結合后生成便于觀察的紫紅色物質[12]。

氣相色譜法流動相為氣體，分離效率較高、分析速度較快、消耗樣品量少、應用廣泛。保留時間是指被測樣品從進樣至最大濃度值出現所需時間，依據保留時間出峰值位置進行定性分析，依據保留時間峰面積進行定量分析[13]。因為SW在高溫下分解，不熊使用常規氣相色譜技術檢測，需在進樣前進行甲基化衍牛反應，使之在高溫下穩定后再檢測。

高效液相色譜法以液體為流動相，靈敏度高、高效高速、定量準確，與氣相色譜法基本原理方面相同，區別在于流動相為液體，調整流動相配較繁瑣，對層析柱要求較高[13]，用此法測定SW的優點是無需進行甲基化衍生。氣相色譜和液相色譜均能與質譜聯用，進行sw定性定量分析。

α- 甘露糖苷酶活性抑制分析法屬于酶標分析法，α一甘露糖苷酶降解底物甘露糖苷，由于SW陽離子結構與甘露糖苷陽離子結構相似，SW與甘露糖苷酶親和力高，從而妨礙（α-甘露糖苷酶與底物的結合，該原理可間接測定SW含量[14]。盧萍課題組分別用氣相一質譜聯用法、液相一質譜聯用法、α-甘露糖苷酶活性抑制分析法測定了小花棘豆內生真菌中sw的含量，重復性良好。

3 真菌SW生物合成途徑

3.1 豆類絲核菌的SW合成途徑

Broquist等從豆類絲核菌中分離出SW，該真菌可合成根霉菌胺及sw兩種生物堿[15]。Harris等推測豆類絲核菌中賴氨酸合成哌啶酸途徑：賴氨酸→酵母氨酸→L-2 -氨基己二酸半醛→1，6-二六氫吡啶羧酸（△1- piperideine -6 - carboxylate，P6C）→哌啶酸一朝。Wickwirc等提出P6C為哌啶酸的直接前體物，哌啶酸是sw的前體物，并推測出哌啶酸的合成途徑為L一賴氨酸→酵母氨酸→P6C→吡啶酸：在酵母氨酸還原酶作用下賴氨酸形成酵母氨酸，在酵母氨酸還原酶作用下酵母氨酸形成L-2-氨基己二酸半醛，發生構型改變生成P6C，1，6-二六氫哌啶酸還原酶作用下生成哌啶酸，與丙二酸反應生成乙二酸哌啶，還原環化生成1—羧基吲哚里西啶，還原羥化生成1，2，8-三羥基吲哚里西啶，即SW[17]。

3.2 金龜子綠僵菌SW合成途徑

金龜子綠僵菌是昆蟲病原真菌，Sim等對金龜子綠僵菌合成SW機理進行研究，發現培養基中添加L-賴氨酸可增加哌啶酸的產量;添加賴氨酸相似物AEC時sw含量減少，酵母氨酸含量增多，菌體內大量酵母氨酸轉變為賴氨酸，認為L-賴氨酸是哌啶酸的前體。推測sw生物合成時，L-賴氨酸在酵母氨酸還原酶作用下生成酵母氨酸，然后酵母氨酸在酵母氨酸氧化酶作用下，生成哌啶酸或α-酮戊二酸，經一系列反應生成α-氨基已二酸半醛，再通過非酶促環化反應形成哌啶酸，最后轉化為sw[18]。

3.3 瘋草內生真菌sw合成途徑

Mukhejee等敲除瘋草Undifilum內生真菌的酵母氨酸還原酶基因，發現突變株中酵母氨酸和賴氨酸含量減少，而哌啶酸和sw含量增多，鑒于P6C是哌啶酸的直接前體，哌啶酸是SW的前體，推測SW生物合成途徑是：α-氨基己二酸→α一氨基己二酸半醛→P6C→哌啶酸→SW;同時，α-氨基己二酸半醛→酵母氨酸→賴氨酸，P6C與酵母氨酸之間可相互轉換[19]。

盧萍課題組克隆了小花棘豆內生真菌酵母氨酸還原酶基因cDNA全長序列（KJ944635）和該基因完整序列（KY052048），構建酵母氨酸還原酶基因缺失突變株。在固體培養基巾添加α -氨基己二酸、L-賴氨酸和哌啶酸三種前體物，培養內生真菌野生株和突變株，發現野生株的SW含量高于突變株;野生株中酵母氨酸含量比突變株高，而賴氨酸含量變化不明顯，賴氨酸促進SW的合成;推測賴氨酸是生物體必需氨基酸，酵母氨酸是賴氨酸合成代謝途徑中間產物，酵母氨酸還原酶基因缺失后，突變株中酵母氨酸的合成受阻，可能從逆反應方向進行，即在酵母氨酸氧化酶的作用下由P6C轉化為酵母氨酸，然后生成賴氨酸，維持機體正常的牛命活動，而P6C是SW合成前體，故突變株中sW的含量降低，而賴氨酸含量保持不變。添加前體化合物均可提高SW含量，其中哌啶酸對SW含量影響最大。

近期研究推測瘋草內生真菌SW生物合成途徑有P6C途徑和P2C途徑[20，21]。在P6C途徑中，L-賴氨酸→酵母氨酸→α -氨基己二酸半醛→P6C，酵母氨酸還原酶催化以上三步反應，P6C在吡咯啉-5-羧酸還原酶作用下生成哌啶酸，然后聚酮合酶催化其生成1-酮基—吲哚里西啶，再經P450家族酶催化生成SW;P2C途徑是新近推測出的另一條SW生物合成途徑，由L-賴氨酸→α-己酮酸- P2C→哌啶酸→1-酮慕一吲哚里西啶→SW，無論是P6C還是P2C，都有許多未解之謎，需深入研究。

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