細菌和激素共暴露建立大鼠盆腔炎模型的方法

黃鳳珍 田貴華 劉敏 李玉桑 張煒 李小軍 唐瀟旖 唐和斌

摘要：建立一種大鼠的急、慢性盆腔炎癥模型，為評價盆腔炎藥物治療效果提供實驗動物工具。采用了以下兩種方法：急性盆腔炙模型建立。將16只成年雌性SPF級Wistar大鼠隨機均分為4組：正常組、大腸桿菌組、金黃色葡萄菌組、大腸桿菌和金黃色葡萄菌混合液組。三個模型組以雌二醇進行預處理一周后，分別采用不同菌種定期染菌30天（1次/7天），并結合疲勞處理。檢測血清超氧化物歧化酶（Superoxide dis-mutase，S（）D）、丙二醛（ Malondialdehyde，MDA）的指標。并采用HE染色觀察病理組織切片的形態學變化;慢性盆腔炎模型的建立。分組同上，接種50夭，檢測血清中SOD與MDA，HE染色以及免疫組織化學染色檢測炎性因子環氧化酶2 （CUX-2）的含量。結果表明：急性盆腔炎模型實驗中，臟器大體觀及組織病理檢查均表明正常組大鼠外陰部均無腫脹，附件臟器無明顯炎癥體征，而三種染菌模型組大鼠急性期外陰部腫脹，輸卵管、子宮內膜、卵巢等附件臟器中出現炎癥、粘連、甚至糜爛;慢性盆腔炎模型實驗中，三種染茵模型組大鼠的各附件臟器也出現炎癥、粘連、甚至糜爛，而且相應組織中COX-2呈高度表達。通過簡易的染菌方式成功制備大鼠的急性、慢性盆腔炎模型。

關鍵詞：盆腔炎;大腸桿菌;金黃色葡萄球菌;HE;環氧化酶—2

中圖分類號：R711

文獻標識碼：A

文章編號：1674-9944（2018）8-0224-05

1 引言

盆腔炎是指女性內生殖器官及周圍的結締組織、盆腔腹膜發生的炎癥[1]。盆腔炎為婦科常見病、難治病。嚴重者可引起敗血癥及膿毒血癥。如不及時控制，可出現感染性休克甚至死亡。但是，目前盆腔炎動物模型與人疾病發生機制不吻合，發病機制不清，嚴重阻礙高效治療盆腔炎藥物的研發。

要研究人體盆腔炎的發生機制，首先要建立與其自然發生過程相似的動物模型。目前公開的盆腔炎動物模型主要有：子宮內膜炎模型和輸卵管炎模型。子宮內膜炎模型主要是由苯酚膠漿劑、鹽酸或異物，通過化學燒傷、腐蝕或異物致炎而引起的，且方法過于強烈，同人體盆腔炎發生的自然過程不符合;輸卵管炎模型包括苯酚膠漿劑致大鼠輸卵管炎模型、兔溶血性鏈球菌感染性輸卵管炎模型、大鼠細菌感染性輸卵管炎模型[2]。這些方法同臨床盆腔炎發生也不相同，且手術難度較大，阻礙模型的應用。臨床研究表明盆腔炎常見的致病因子為細菌（包括需氧菌和厭氧菌），也有病毒、霉菌、支原體、衣原體等。因此，本實驗采用大腸桿菌、金黃色葡萄桿菌、混合菌液結合激素紊亂的造模法建立急性和慢性盆腔炎大鼠模型，測定大鼠血清MDA、SOD的含量變化以及采集各附件臟器標本進行組織病理學鏡檢。

2 材料和方法

2.1 實驗動物

SPF級雌性Wistar大鼠32只，體重200～220 g。購自湖北省實驗動物研究中心[SCXK（鄂）2008 -0005]，動物實驗內容及操作均獲中南民族大學動物實驗倫理委員會審批許可后[ 2012 - SCUEC - AEC -002]，在巾南民族大學藥學院SPF級屏障實驗設施中進行[SYXK（鄂）2014 - 0078]。實驗前適應性喂養1周，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。對小鼠的處理符合2006年中國科學技術部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》[3]。

2.2 試劑與儀器

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色鏈球菌由武漢大學中國典型培養物保藏中心提供;牛肉膏蛋白胨固體培養基（牛肉膏，蛋白胨，NaCI2，0.1 M NaOH，0.1 MHC1，0.1 M PBS）;蘇木精購自南京建成科技有限公司;伊紅購自美國Amresco公司;多聚甲醛、無水乙醇、二甲苯購自國藥集團化學試劑有限公司。TP1020脫水機（德國Leica公司）;EG0050H石蠟包埋機（德國Leica公司）;RM2265切片機（德國Leica公司）;ALC- 210.3型電子分析天平（德國Acculab公司）;Nikon50i顯微成像系統（口本Nikon公司）。

2.3 實驗方法

2.3.1 菌液的配制

用適量的肉湯溶解凍干細菌后，移人5 mL肉湯培養基中，置于37℃孵育箱培養2天，使細菌復活增殖。

2.3.2 動物造模與分組

選用無生殖道疾病的雌性大鼠，在接種前，采用雌二醇（0.1 mL/100 g，2 mg/mL）金科藥業）處理1周。將大鼠在嚴格無菌的條件下采用1mL注射器將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和混合菌液于大鼠陰道中接種4周，每周2次。于第一次接種5周后，各組大鼠眼眶取血2 mL，注入潔凈的干燥試管中，待血液標本自然凝固后，以3500 r/min速度離心10 min，提取血清，分裝入1.5 mLEP管中，置-80？ C超低溫冰箱中保存，用于血清MDA含量，SOD活力測定。經取血后，快速脫臼處死動物。打開腹腔，并摘取生殖器官，如：陰道、子宮、輸卵管、卵巢，與無菌生理鹽水巾充分漂洗，固定48 h后用于病理學檢查。

2.3.3 大鼠血清MDA含量和SOD活力測定

（1）丙二酶（MDA）濃度測定方法。采用硫代巴比妥酸（ Thibabaturic，TBA）比色法，利用酶標儀于波長532 nm比色測定，試劑含量單位μmol/g。其測定原理為：過氧化脂質降解產物中的MDA可與TBA縮合，形成紅色產物，在532nm處有最大吸收峰。計算公式：血清中MDA含量=（測定組OD值一對照組OD值）/（標準組OD值=空白組OD值）×標準品濃度×樣本測試前稀釋倍數，單位是nmol/mL。

（2）超氧化物歧化酶（SOD）測定法：采用黃嘌呤氧化酶法，步驟按照試劑盒說明書進行操作，試劑含量單位：nU/mg。其測定原理是：通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈現紫紅色，用可見光分光光度計測其吸光度。當被測樣品中含SOD時，SOD能夠催化超氧陰離子歧化，使形成亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，通過公式計算被測樣品中的SOD活力。按公式計算SOD的抑制率，SOD抑制率（%）=[（對照組一對照組空白）一（測定組一測定組空白）]/（對照組一對照組空白）×100%。血清中SOD活力（U/mL）=SOD抑制率÷50%×反應體系稀釋倍數（0.24 mL/O.02 mL）×樣本測試的稀釋倍數。

2.3.4 病理觀察

切取所有實驗組大鼠生殖器官，如：陰道，子宮，輸卵管，卵巢，4%多聚甲醛溶液固定24 h，常規石蠟包埋，切片機制成3μm連續石蠟切片;同步烤片，然后脫蠟，梯度酒精水化，蘇木精—伊紅染色（hematoxylin and eo-sin，HE）染色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹脂封片;光鏡下胞質染為紅色，細胞核染為藍色。

2.4 統計學處理

所有數據采用GraphPad Prism 5.0.1科學統計繪圖軟件進行分析，并以x±s表示，組間比較采用雙向方差分析（ Two - way ANOVA），以P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 革藍氏染色結果

以陰道涂片的方法觀察雌鼠不同發情周期陰道上皮細胞的變化類型，并同時記錄其外陰部的特點，根據小鼠不同發情周期所表現出的陰部特點依次將其分為發情前期、發情期、間情期。在發情前期，可見白細胞游走;在發情期，則全是核化細，無白細胞、有核細胞;在發情間期，無白細胞游走，可見有核細胞、角化細胞。各周期的革蘭氏染色結果，見圖1（A）。模型制備期間，生理周期的檢測結果表明細菌接種引起大鼠生理周期的延長或紊亂，考慮為炎癥所致。圖1（B）為陰道內容物的革蘭氏染色結果。

3.2 大鼠急性、慢性盆腔炎模型血清中SOD和MDA的變化

在大鼠盆腔炎急性期造模過程中，相對于正常組，大腸桿菌組和混合菌組的SOD值均有所降低。大腸桿菌組、金色葡萄球菌組和混合菌組的MDA水平均顯著性高于正常組，分別是正常組的6.61倍、9.69倍以及6.37倍（P

在大鼠盆腔炎慢性造模過程中，相對于正常組，金色葡萄球菌組的SOD值顯著性下降（P<0.001）。大腸桿菌組、金色葡萄球菌組和混合菌組的MDA含量較前期有砦下降但仍高于對照組。金色葡萄球菌組和混合菌組SOD/MDA的比值與正常組相比，顯出特異性低下。以上數據表明三個模型組處于炎癥期，說明本次大鼠慢性盆腔炎模型炎癥狀態形成（表2）。

3.3 大鼠生殖器組織的肉眼和病理觀察

大鼠生殖器組織標本的肉眼觀察，正常組盆腔臟器表面無充血、水腫或粘連。輸卵管無腫脹，管壁彈性未發生改變。急性期造模中，模型組接種后第3天發現外陰部紅腫，分泌物增多。接種第30天，模型組外陰可見明顯腫脹和炎性分泌物，其中金黃色葡萄球菌組最為明顯。解剖后可見模型組陰道腫脹，子宮充血積液，卵巢出現明顯的囊泡，整體硬度顯著增大，且與周圍器官組織黏連難分離。其中大腸桿菌組輸卯管和子宮呈現嚴重腫大，金色葡萄球菌組次之。慢性期造模中，接種第50天，模型組外陰可見少量炎性分泌物。相對急性期，其外陰腫脹程度和分泌物數量有所減少。解剖前后體征對照比較，大腸桿菌組肉眼可見腹腔下部充血，子宮、輸卵管明顯增粗、腫脹，盆腔廣泛粘連不易分離。金色葡萄球菌組肉眼可見子宮大量積液，擴張的子宮、輸卵管有膿一樣粘稠物質。混合菌組肉眼可見子宮、輸卵管腫脹變硬，與內在臟器粘連，特別是卵巢部位出現明顯囊泡，考慮為炎性表征。三個模型組的大鼠的直腸附近出現局部血腫塊（圖2、圖3）。

光鏡下觀察，正常組間皮細胞呈單層扁平，核旱扁圓形，位于細胞中央。輸卵管壁組織結構清晰，管腔通暢，黏膜上皮呈柱狀，纖毛存在。急性期造模中，大腸桿菌組明顯可見子宮黏膜上皮明顯壞死變性，肌層和固有層均有明顯結締組織增生和炎細胞浸潤，肌層排列紊亂，管腔有一定的粘連阻塞，漿膜層有散在炎細胞浸潤。金色葡萄球菌組出現輸卵管管腔擴大，黏膜皺壁和肌層充血，水腫，黏膜乳頭增生，互相粘合成網狀，間質炎細胞浸潤。混合菌組附件組織中上皮細胞壞死，大量炎性細胞伴充血水腫。官腔上皮破壞，粘膜下充血，水腫，大量的中性粒細胞呈局部灶浸潤，腺體破壞，失去正常結構。慢性期造模中，大腸桿菌組，金色葡萄球菌組和混合菌組均不間程度地出現明顯的子宮粘連、炎癥浸潤、黏膜層水腫、腺體破壞或減少等變化，與人類慢性盆腔炎疾病表現相似（圖2、圖3）。

3.4 慢性盆腔炎大鼠子宮附件中環氧化酶-2的高度表達

將接種50天的大鼠處死后，取子宮及子宮附件組織石蠟包埋后切片后，進行免疫組織化學染色，染色結果如圖4所示。正常組的COX-2表達不明顯，大腸桿菌組卵巢內具有豐富的血管、炎性細胞中COX-2蛋白高表達;子宮粘膜層到漿膜層內大量炎性細胞中C（）X-2蛋白高表達;輸卵管及其周圍組織炎性細胞中COX-2蛋白高表達。金黃色葡萄球菌組子宮上皮層至肌層漿細胞，淋巴細胞等慢性炎細胞侵入。混合菌組輸卵管及其周圍組織炎性細胞中COX-2蛋白高表達說明該造模方式會引起體內炎性因子的大量分泌，與臨床相符。

4 討論

盆腔炎是指女性生殖器官及周圍的結締組織、腹膜發生炎癥，包括子宮內膜炎、輸卵管炎、卵巢炎、附件炎等[4，5]。根據其病程經過，盆腔炎分為急性盆腔炎和慢性盆腔炎。盆腔炎往往是由需氧菌和厭氧菌混合感染引起的，其中常見的致病體有鏈球菌、淋球菌、支原體、衣原體、葡萄球菌、大腸桿菌、厭氧菌及性傳播等病原體[6]。革蘭陽性的葡萄球菌是產后、手術后、生殖器炎癥及傷口感染常見的致病菌。大腸埃希菌是腸道及陰道的正常寄生菌，一般不致病，但當機體極度衰弱及生殖道有損傷時可引起嚴重感染。本研究選擇了上述兩種細菌作為研究對象。

傳統造模方法即將苯酚膠漿或鹽酸作為致炎劑注人大鼠的一側子宮或輸卵管，大鼠順應性差，組織損傷嚴重，死亡率高。在本實驗小，通過將大腸桿菌或金黃色葡萄球菌經陰道給藥，增加了小鼠服藥的順應性，致炎途徑及病變機制接近于臨床盆腔炎的發生與病變。接種30天時，大腸桿菌組、金黃色葡萄球菌組和混合菌組大鼠的外陰和盆腔附件臟器可見明顯腫脹或炎性分泌物，特別是模型組卵巢部位明顯囊泡，考慮為炎性表征。其中，混合菌組的附件臟器糜爛程度最為嚴重，即長期陰道給予細菌混合液能更好地建立急性盆腔炎模型。

SOD是人體內清除氧自由基的主要抗氧化酶之一，在細胞內和各種體液中廣泛分布，因此血清SOD水平反映了機體清除氧自由基的能力。研究表明盆腔炎的病理生理過程均與SOD的代謝失常有關[7]，盆腔炎患者因長期炎癥反應，體內氧自由基生成過多，因此血清SOD活性下降、水平降低。慢性炎癥時出現氧自由基形成和清除失衡，引發脂質過氧化反應，而MDA是脂質過氧化反應的穩定代謝產物，直接反映組織中氧自由基引起的脂質過氧化反應的程度，也可間接反映細胞損傷的程度[8]。在本實驗中，解剖后血樣中SOD、MDA含量的檢測，結果表明大腸桿菌組、金黃色葡萄球菌組和混合菌組的MDA含量特異性增高，且三個模型組的SOD/MDA的比值與正常組相比，顯出特異性低下。表明本次急性造模成功。

環氧化酶-2（COX -2）是炎癥相關因子，與機體損傷及炎癥的發生有密切聯系[9，10]。在本實驗過程中對附件臟器的切片進行了免疫組織化學染色以觀察COX-2的表達變化。在給予激素刺激和細菌感染的基礎上，相對于正常組，模型組中子宮粘膜層到漿膜層、卵巢、輸卵管及其周圍組織內大量炎性細胞中COX -2蛋白高表達。由此可見，該造模方式不僅引起實驗動物盆腔組織外觀的變化，也極大地刺激了體內的炎癥因子的高度表達。

本實驗設立了陰道給予大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和混合菌50天模擬臨床上由急性期遷延為慢性期的盆腔炎。50天后，大腸桿菌組、金黃色葡萄球菌組和混合菌組在直腸附近出現局部血腫塊。與急性盆腔炎的模型組相比，外陰腫脹消退。腸桿菌組、金黃色葡萄球菌組和混合菌組的附件臟器均可見細胞壞死，炎細胞浸潤及組織結構紊亂。血清中的SOD/MDA的比值相對于空白組顯著性降低。表明采用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌建立慢性盆腔炎模型成功。

理想的盆腔炎動物模型應與人類大多數盆腔炎病理組織類型相一致，具有相似的致病菌、感染因素、感染途徑、病變特點以及操作簡便、復制迅速、成功率高、重復性好的特點。本實驗采用大鼠，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為致炎劑，通過陰道給藥，先后在30天、50天時成功建立了大鼠的急性、慢性盆腔炎模型。本實驗的盆腔炎模型采用了需氧細菌，雖未考慮其他致病因子，如厭氧菌、病原體、病毒等，但目前模型建立的成功率高（近100%），不依賴免疫抑制劑。操作方法簡單易行，材料易得，方法易掌握，對使用者無特殊技術要求，并符合盆腔炎臨床自然發生病理特點，適用于盆腔炎發生、發展及其機制的研究和相關藥物的篩選。

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