關于基因敲除技術的淺介

常海斌+侯占銘

摘要：現今世界上最熱門的科學課題之一是生物體的基因功能研究?；蚯贸╣ene knockout）技術是研究基因功能最直接有效的一種遺傳功能技術。該技術是科學家通過一定的方法使生物體內特定的基因缺失或失活的一種高科技技術。改變生物體的遺傳基因，令特定的基因功能喪失，從而使部分功能被屏蔽，觀察對生物體造成的影響，進而推測出這些基因的生物學功能?；蚯贸夹g主要是使用DNA同源重組原理，隨著科學的進步和基因敲除技術的發展，除了同源重組以外，許多新的原理和技術也逐漸被采用，例如現今比較成功的基因敲除方法還有ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas技術等。筆者對基因敲除技術基本原理和其在各個方面的應用做了簡要的介紹。

關鍵詞：基因敲除；基因功能；ZFNs；TALENs；CRISPR/Cas

基因敲除技術在20世紀80年代后期快速發展，該技術是建立在胚胎干細胞技術和基因同源重組技術基礎上的新型分子生物學技術。條件型基因敲除與完全基因敲除是基因敲除的兩個分支。條件基因敲除是使靶基因在特定的發育階段或細胞類型中完全喪失功能的科學技術。完全基因敲除是運用同源重組的方法徹底去除細胞中靶基因的活性，這種方法比較簡單。美國遺傳學家Mario R.Capecchi和Oliver Smithies以及英國遺傳學家Martin J.Evans被授予2007年度諾貝爾生理學或醫學獎，以此來嘉獎三位科學家在利用胚胎干細胞對小鼠進行特性基因修飾技術時的重大突破。為了提高基因敲除的特異性和效率，科學家們不斷創新研究，發現了諸如ZFNs、TALENs以及CRISPR/Cas等許多基因高效靶向修飾和調控技術。這些在世界上新興起的基因敲除技術為科研工作者對基因功能的研究提供了新的方法，使生命科學技術又向前邁進了一大步。

一、 基因敲除技術的主要方法

（一） 利用隨機插入突變的方法

該方法的優點是敲除效率較高、可以使基因徹底失去活性及方便分離鑒別。從分類上來講，隨機插入突變可劃分為轉座子插入突變與TDNA插入突變。轉座子插入突變僅適用于存在內源活性轉位子的植物，但在實際中此類植物并不是很多。使用根癌農桿菌TDNA介導轉化是TDNA插入失活技術的基本原理，即在基因組DNA上將一段擁有報告基因的DNA序列整合，這樣產生的插入突變在植物基因組DNA中很穩定，插入位點的隨機性也較強，但是植物只有容易被TDNA轉化時此法才適用，而且易于產生染色體重排現象，使實驗后續的遺傳學實驗變得艱難?，F今該方法在擬南芥的研究中使用的較多。

（二） 利用同源重組的方法

使用DNA同源重組原理，用預先設計的同源片段代替靶基因片段，在受體細胞基因組與外源DNA中，發生同源重組的是序列一致或者相仿的基因，導致替換受體細胞基因組里的一致或相仿的序列，整合至受體細胞的基因組里。以此達到基因敲除的目的。該技術專一性強、整合位點精確，可以將外源基因導入基因組DNA的特定片段并使其穩定遺傳。但是該方法的缺點是極其依靠細胞里自然出現的同源染色體隨機互換，不過在自然情況下重組效率極低，并且實驗重復性較差，需要很大的工作量才可以完成實驗操作，況且單一地使用同源重組是無法永久修復人類基因組。

現今經過科學家的不斷探索，人工核酸內切酶（Engineered endonuclease，EEN）技術的誕生令基因敲除更加容易，基因編輯的準確性與高效性以及實驗的重復性都得到了大幅提高。EEN在特異性核酸序列介導下，對特異性DNA位點剪切的是核酸內切酶，形成雙鏈斷裂切口（double strand breaks，DSB），然后啟動機體的DNA自我修復機制，對已經斷裂的雙鏈核酸進行修復。DSB修復機制包括非同源末端重組和同源重組兩種形式。非同源末端重組是在對DSB末端簡單加工后的直接連接，連接過程極易發生堿基的丟失和錯配，最終結果是造成基因功能的喪失并實現基因的定點敲除。精確的基因靶向修飾技術能探索基因的功能，這對于了解病癥的發生機制并確定治療手段具有指導性意義。在多細胞生物尤其是在植物中，DSB的修復途徑以非同源末端重組為主?，F今在科學研究應用得較多的三種EEN主要有ZFNs和TALENs技術以及CRISPR/Cas系統。

（三） ZFNs

每個鋅指核酸酶（Zincfinger nucleases，ZFNs）單體在結構上都是由鋅指蛋白（zincfinger protein，ZFP）和非特異核酸酶結合的人工合成酶。該酶N端部分可識別含有特定DNA序列的鋅指蛋白，C端部分由非特異性切割結構域Fok I及連接DNA結合結構域和內切酶的肽段構成。ZFNs是將特異性識別模塊和功能模塊這2個有特定功能的結構域融合，達到形成具有特殊功能蛋白的目的。在ZFP結構域當中，最經典的結構類型是Cys2His2。ZFP結構域可以對核苷酸三聯體進行特異性識別，因此將不同ZFP結構域有序地結合在一起，便可完成對一段核苷酸序列的靶向結合。

Fok I的C端的96個氨基酸殘基可以組成DNA剪切域，而與鋅指蛋白相連的非特異性核酸內切酶便來自于此，所以識別特定位點時是一個鋅指蛋白組和Fok I單體連接形成一個ZFN。有活性的Fok I核酸內切酶是以二聚體形式存在的，因此ZFN也應以二聚體的形式發揮功能。2個單體ZFN在兩個識別位點距離6～8bp時會相互作用產生酶切功能。1個DNA雙鏈切口便在這個特異位點當中產生了，接下來進行切口修復的機制便是細胞的同源重組或非同源末端修復，便可達到定點精準修飾的目標。ZFN的特異性取決于鋅指蛋白，所以篩選高質量的鋅指蛋白才可以獲得高效且有特異性的ZFN。

ZFNs是最早被廣泛使用的基因組編輯技術，該技術的優點是技術平臺很完善，可利用資源豐富，可針對特定序列設計ZFN以實現對靶基因的修飾。ZFNs可以精確地修飾基因以及其周圍的調控元件，ZFNs技術極大地提高了基因敲除的效率，許多研究人類疾病的動物模型便是由該技術構建。但是ZFNs技術制備成本較高；而且脫靶率高，會導致切割基因組非特性序列，造成未知突變，導致后期鑒定工作量的增加；對目標DNA序列及其上下游序列依賴性高，因此設計高親和性的ZFNs比較難；FNs在細胞中的表達最終還會產生細胞毒性。這些局限性在很大程度上降低了ZFNs設計與篩選的效率。endprint