參芪顆粒對環磷酰胺致骨髓抑制小鼠模型的影響

鄭佳琳，黃小紅，饒子亮，梁艷齡，黃小瓊，劉盛來，曾素丹，鐘志勇，鄺少松

（廣東省醫學實驗動物中心比較醫學實驗室，廣東 佛山 528248）

放化療是各種腫瘤治療的主要手段，其臨床應用十分廣泛。骨髓抑制是腫瘤放、化療的主要毒副作用，表現為外周血單系或全系血細胞的減少，不僅限制化療用的藥劑量還延誤治療節奏，影響治療效果。臨床常出現嚴重的感染和出血，嚴重影響生命并威脅患者的生命。目前在西醫用來起預防骨髓抑制作用的藥物很少，且很難得到推廣應用，西醫藥副作用大。中醫學多將化療后骨髓抑制歸于脾腎兩虛、氣血不足[1,2]，但療效仍然還不盡理想，臨床多以補血為主。參芪顆粒主要作用以及適應癥為補益中氣，用于氣虛所致體弱，四肢無力，與骨髓抑制的病征相對應。本研究利用環磷酰胺藥物作用使小鼠骨髓造血功能受到抑制，觀察參芪顆粒對小鼠造血功能的影響，探究參芪顆粒對放、化療引起的骨髓造血抑制的預防、治療作用，并對其作用作初步探討。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及實驗環境

SPF級BALB/c小鼠，雄性，體重18～22g，購于廣東省醫學實驗動物中心〔SCXK（粵）

2013-0002 〕。動物飼養在廣東省醫學實驗動物中心SPF級動物房〔SYXK（粵）2013-0002〕。動物飼養條件：5只/箱，群養，飼養溫度與濕度：20～26℃，40～70%，采用10h：14h晝夜間斷照明；飼養室條件始終保持穩定，以保證試驗結果的可靠性。自由進食飲水，飼料和飲用水均由廣東省醫學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑

參芪顆粒（批號：140801），江西保利制藥有限公司；環磷酰胺（CTX，批號：04131202），山西普德藥業股份有限公司；重組人粒細胞集落刺激因子注射液（rhG–CSF，批號：20140101），北京四環生物制藥有限公司；細胞周期試劑盒（批號：No.20131050）上海七海復泰生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

JEA3001系列電子天平，精度0.1g，中山市衡新電子有限公司；Mek-7222k型全自動血球計數儀，日本光電。BD AccuriC6流式細胞儀，美國BD公司。

1.4 動物造模

將檢疫合格的40只BALB/c小鼠按照體重隨機分為空白對照組、模型組、陽性組、參芪顆粒組，每組10只。除空白對照組外，其余各組小鼠腹腔注射80mg·kg-1·d-1環磷酰胺溶液，正常對照組小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，每天1次，連續3d；本實驗所有動物實驗操作均經過廣東省醫學實驗動物中心實驗動物倫理委員會批準。

1.5 動物給藥

造模結束后，參芪顆粒組小鼠每日灌胃給予18.2g·kg-1·d-1參芪顆粒溶液，陽性組小鼠每日腹腔注射125μg·kg-1·d-1 rhG–CSF，每天1次，連續給藥7d。空白對照組和模型組均灌胃給予0.9%氯化鈉注射液。

1.6 外周血細胞計數

末次給藥24h后，經小鼠眼球后靜脈叢采血，用裝有EDTANa抗凝劑的采血管收集，使用Mek-7222k型全自動生化分析儀進行白細胞總數 (WBC) ，紅細胞 (RBC) ，血小板(PLT) 計數。

1.7 骨髓有核細胞懸液的制備及有核細胞計數

末次給藥后24h，脫臼頸椎處死小鼠，取小鼠股骨，除凈軟組織，用6號針頭以1mL PBS沖出骨髓細胞，200目篩網過濾制成單個骨髓細胞懸液。將單個骨髓細胞懸液1000 rmp離心5min，去上清，用預冷PBS洗滌2 次，棄上清，用 PBS定容至5mL。按白細胞計數法進行骨髓有核細胞計數。并計算絕對數量。

1.8 骨髓有核細胞細胞周期的分析測定

取上述制備好的骨髓單核細胞懸液離心(1000rmp，5min)，棄上清，加入70%預冷乙醇固定打散細胞，4℃固定2h，1000rmp離心5min收集細胞，棄上清，用預冷PBS洗細胞兩次。1000rmp離心收集已固定的細胞，棄上清，加入1mL PBS室溫水合15min。離心收集細胞，棄上清，每管加入500μL碘化丙啶染色液，室溫避光孵育30min。以標準程序用流式細胞儀檢測，一般計數1～2萬個細胞，結果用軟件FlowJo7.6分析細胞周期。結果以細胞周期各時相細胞百分率表示，并按以下公式計算細胞增殖指數(proliferation index, PI)：PI=(S+G2/M) /(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.9 細胞凋亡率的測定

取上述制備好的骨髓單核細胞懸液離心(1000rmp，5min)，棄上清液，PBS洗滌后，PI染色上流式細胞儀進行分析，計算凋亡細胞百分率。

1.10 統計方法

實驗所得數據用 SPSS 21.0 軟件統計，結果用表示，各組數據進行方差齊性檢驗，同時進行單因素方差分析。

2 結果

2.1 參芪顆粒對骨髓抑制小鼠外周血的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠外周血中白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）、血小板計數（PLT）的數量顯著減少(P＜0.01)，證明造模成功。參芪顆粒組、陽性組均能明顯改善骨髓抑制小鼠外周血中 WBC、PLT的數量，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表1。

2.2 參芪顆粒對骨髓抑制小鼠骨髓有核細胞的影響

與空白對照組比較，模型組小鼠骨髓有核細胞（BMC）數量顯著低于空白對照組(P＜0.01) 。參芪顆粒組、陽性組均可以顯增加骨髓抑制小鼠的骨髓有核細胞數量，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。結果見表1。

2.3 參芪顆粒對骨髓抑制小鼠骨髓細胞周期變化和細胞凋亡率的影響

與空白對照組比較，造模后骨髓細胞細胞周期出現了停滯的狀態，模型組小鼠G0/G1期細胞顯著增加，G2/M 期和 S 期細胞顯著減少(P＜0.05或P＜0.01)。參芪顆粒組和陽性組均能解除 G0/G1期細胞阻滯，促進 G0/G1期細胞進入增殖周期，使G2/M期和S期細胞增加，且兩組之間無顯著差異（P＞0.05）。結果見表2。

表1 參芪顆粒對骨髓抑制小鼠外周血象及骨髓有核細胞的影響（ ，n=10，♂）

表1 參芪顆粒對骨髓抑制小鼠外周血象及骨髓有核細胞的影響（ ，n=10，♂）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別Group空白對照組Blank模型組Model陽性組Positive參芪顆粒組Shenqi Granule劑量Dosage WBC（×109/L）RBC（×1012/L）PLT（×109/L）BMC（×109/L）— —7.64±0.45 2.03±0.28**10.39±1.19 3.71±0.46**287.63±20.96 153.12±18.20**8.96±0.96 2.46±0.47**125μg·kg-1·d-15.63±0.49△△4.03±0.97242.14±26.71△△6.14±0.89△△18.2g·kg-1·d-14.58±0.72△△3.97±0.56211.86±23.17△△3.23±0.92△

表2 參芪顆粒對骨髓抑制小鼠骨髓細胞周期和細胞凋亡率的影響（ ，n=10，♂）

表2 參芪顆粒對骨髓抑制小鼠骨髓細胞周期和細胞凋亡率的影響（ ，n=10，♂）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別Group空白對照組Blank模型組Model陽性組Positive參芪顆粒組Shenqi Granule劑量Dosage G0/G1（%）S（%）G2/M（%）PI（%）— —72.06±1.38 85.48±1.70**15.12±1.66 5.45±1.67**8.12±2.11 6.95±2.05*24.55±2.06 12.10±1.73**125μg·kg-1·d-177.36±3.99△△12.02±4.80△△9.54±1.06△△20.35±4.97△△凋亡率（%）Apoptosis rate 2.650.45 27.330.28**20.650.49△18.2g·kg-1·d-180.83±1.78△△7.38±1.36△△7.82±1.6017.98±1.35△22.340.72△

與空白對照組比較，模型組小鼠骨髓細胞的凋亡率極顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，陽性組和參芪顆粒組的骨髓細胞的凋亡率顯著下降（P＜0.05）。提示∶參芪顆粒具有抑制骨髓細胞凋亡的作用。結果見表2。

3 討論

參芪顆粒具有補中益氣，健脾益肺的功效，藥效與骨髓抑制的病癥相類似。中藥配方顆粒可滿足臨床辨證論治，隨癥加減的需要，同時服用方便，保持和發揚了傳統中醫藥的特點和優勢，既有利于中藥質量的規范化，亦有利于中藥的標準化和國際化。

化學治療、放射治療以及許多其它抗腫瘤治療方法，都是針對快速分裂的細胞來抑制癌細胞，因而常常導致正常骨髓細胞受抑。小鼠骨髓抑制模型的造模方法中輻照方法和環磷酰胺法比較簡便。輻照方法和環磷酰胺注射法對比，射線輻射復制的骨髓抑制模型較接近臨床上的再生障礙性貧血，但特殊設備，輻射劑量、時間難以控制，造模條件、成本高[3]。環磷酰胺是一種臨床常見的抗腫瘤藥物，廣泛應用于各種血液系統和實體腫瘤的治療，具有誘導腫瘤細胞凋亡和抑制細胞增殖的作用[4]。注射用環磷酰胺在體外無活性，與DNA發生交叉聯結，抑制DNA的合成，也可干擾RNA的功能。抑制骨髓細胞的生成，干擾細胞的造血活動，劑量容易控制，故選用環磷酰胺法制備小鼠骨髓抑制模型。本研究采用80mg·kg-1·d-1環磷酰胺連續腹腔注射三d，其外周血中白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）、血小板計數（PLT）、BMC的數量顯著減少(P＜0.05或P＜0.01)，并且重復性高。

骨髓細胞周期是評判其造血系統造血功能好壞的重要指標之一，細胞周期各個時相的分布情況可以反映骨髓細胞受損和恢復的程度[5]。在細胞周期調控機制中有兩個重要的檢查點，分別位于G1期與S期、G2期與M期之間[6]。目前研究認為，機體受到輻射等外界刺激后，會發生保護性反應，出現G1期阻滯、G2期阻滯或S期的延遲，使受損DNA有充足時間來進行修復，損傷嚴重者通過G1期的永久性阻滯或發生凋亡而清除有損傷DNA的細胞，從而降低基因組的不穩定性[7]。解除骨髓細胞G1期阻滯，使G1期細胞進入S期，S期細胞向G2/M期細胞轉化是拮抗放、化療藥物造成的骨髓抑制的一個重要機制[8,9]。

本研究顯示模型組和空白對照組比較，其骨髓有核細胞G0/G1期，S期細胞比例明顯升高，G2/M期細胞下降，細胞凋亡率也有顯著升高。數據提示，放化療不僅引起G1期阻滯，還會造成S期阻滯，即細胞的蛋白質和RNA、DNA不能很好地合成，受到抑制，并且會通過促進細胞凋亡，抑制新細胞的增殖，而導致骨髓抑制。陽性組和參芪顆粒和模型組對比，G0/G1比例降低，S期、G2/M期細胞比例升高，細胞增殖指數升高，凋亡率也有下降。以上實驗結果提示，參芪顆粒以通過促進G0/G1期的造血細胞修復受損的DNA，加速通過G1/S和S期監測點；抑制造血細胞的凋亡；調節造血細胞增殖與凋亡之間的平衡等機制來促進放、化療骨髓抑制的小鼠造血功能恢復，提高外周血象，有利于緩解骨髓抑制病征。

[1]劉啟華,王旭.益氣補血湯治療化療后白細胞減少89例療效觀察[J].中國醫藥科,2007, 14（6）:447.

[2]苗文紅.補腎健脾法治療腫瘤放化療后髓抑制98例[J].陜西中醫,2000,21(7):289.

[3]嚴蘇純,祝彼得,韓英光,郭巍.當歸補血湯不同劑型及配伍對骨髓抑制小鼠造血調控的實驗研究[J].中國藥學雜志,2008,9(43):18.

[4]鄧震亭.環磷酰胺藥理與毒理研究現狀[J].天津藥學,2009,21(4):42.

[5]趙菊花,祝彼得.圣愈湯不同劑型對骨髓抑制小鼠骨髓細胞周期和凋亡影響的研究[J].中藥藥理與臨床,2011,27(2).

[6] Ismels ED,Israels LG.The cell cycle.[J].Stem Cell,2001,19(1):88－91.

[7]馬淑梅,付士波,鞠桂芝.電離輻射對小鼠骨髓造血細胞周期進程的影響[J].輻射研究與輻射工藝學報,2000,18(2):104－10.

[8]Sherr CJ.Cancer cell cycles.[J].Science,1996,274(5293):1672－1673.

[9]Sherr CJ.The Pezcoller lecture: Cancer cell cycles revisited[J].cancer Res,2001, 60(14):3689－3692.