一年生喜樹生長規(guī)律及葉片中喜樹堿含量季節(jié)性變化研究*

劉 波劉曦子 蘇祿暉朱麗紅楊 意

（1.上海市醫(yī)藥學(xué)校，上海 200135；2.南京大學(xué)金陵學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210037；3.上海市浦東新區(qū)公路管理署，上海 200129）

喜樹 （Camptotheca acuminata） 為珙桐科（Nyssaceae）喜樹屬（Camptotheca Decne.）植物，我國特有高大落葉喬木，主要分布于我國長江流域、西南各省區(qū)及印度部分地區(qū)，屬國家二級(jí)保護(hù)樹種[1-2]。喜樹根、莖、葉、果實(shí)及種子中提取的喜樹堿（Camptothecin，CPT）是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一種拓?fù)洚悩?gòu)酶I（Topoisomerase I）的抑制劑，具有廣譜抗癌活性，可用于胃癌、直腸癌、慢性粒細(xì)胞性白血病和急性淋巴性白血病的治療[3-6]。

近幾年來，各國學(xué)者對(duì)喜樹堿的生物活性成分進(jìn)行了廣泛的研究[7-16]，喜樹已成為世界性熱門研究課題。已有文獻(xiàn)報(bào)道了不同種源喜樹中CPT含量、不同省區(qū)喜樹葉中CPT含量、喜樹各器官中CPT含量、喜樹不同發(fā)育階段葉片中CPT含量以及不同生長季節(jié)嫩葉和成熟葉中喜樹堿的動(dòng)態(tài)變化[13，17-22]，且喜樹各組織器官中，嫩葉中CPT含量可以達(dá)到植株地上部分平均含量的4倍[23-24]，但對(duì)于1年生喜樹生長發(fā)育以及不同葉齡喜樹葉片中CPT含量研究較少。本文采用HPLC色譜法對(duì)喜樹嫩葉和成熟葉中CPT的含量以及不同葉齡葉片中CPT含量進(jìn)行研究，同時(shí)對(duì)當(dāng)年生喜樹生長規(guī)律進(jìn)行研究探討，以期為藥用喜樹種植栽培，科學(xué)合理地開發(fā)喜樹資源，以及喜樹和喜樹堿產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，提高資源利用率和生產(chǎn)率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為1年生喜樹，種源為四川都江堰，種植地為上海市浦東新區(qū)劃某綠化養(yǎng)護(hù)公司苗圃。以整個(gè)植株、植株新梢上的嫩葉（枝頂1～3位葉）和成熟葉作（枝條中下部葉，葉片深綠色）為試驗(yàn)材料。

2016年4～11月份，分別于每月中旬及月底采集喜樹嫩葉與成熟葉，采集時(shí)間均為早上9∶00。不同葉齡葉片喜樹堿含量測(cè)定，每5天采集1次喜樹葉片，采集時(shí)間均為早上9∶00。

所有采集后的樣品均用清水洗凈，60℃烘干，恒重，粉碎至60目，干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑

Jasco高效液相色譜儀、975型紫外檢測(cè)器、TG328A型電子天平、Heraeus Biofuge 22R型高速冷凍離心機(jī)、Buchi R210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、索氏提取器。

乙腈（色譜純）、無水乙醇（分析純）、95%乙醇和重蒸餾水。

1.3 色譜條件

色譜Waters ODS柱（25 cm×4.6 mm）；流動(dòng)相：乙腈 - 水（V/V=4∶6）；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：25 ℃。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

精密稱取喜樹堿對(duì)照品3.5 mg，置于100 mL容量瓶中，以乙腈-水（4∶6）為溶劑，超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻、定容，備用。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸取喜樹堿1.0、2.0、3.0……9.0 mL于10 mL容量瓶中，用相同溶劑定容至刻度，搖勻。按照上述色譜條件，分別取稀釋后樣品及原標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取峰面積的平均值。得峰面積（Y）與喜樹堿濃度（X）的線性回歸方程：Y=1 807.49X-1 343，R2=0.999 5。

1.6 喜樹堿提取

精密稱取干燥喜樹葉粉3.000 g，用30 mL 95%乙醇，索氏提取8 h，提取3次，合并提取液。用移液管精密吸取提取液200 μL，移入2 mL離心管中，用95%乙醇稀釋6倍，12 000 r/min條件下離心5 min，精密吸取上清液，直接進(jìn)樣，計(jì)算喜樹堿提取率。

1.7 喜樹生長測(cè)定

2016年4～11月，于每月中旬、月底選擇10株喜樹幼樹，分別用卷尺和游標(biāo)卡尺測(cè)定株高、基徑。測(cè)定時(shí)間均為早上9：00。

喜樹生物量測(cè)定：用TG328A型電子天平精確稱定樹根、莖、葉，105℃左右烘干6 h，取出，精密稱重至恒重。

2 結(jié)果與分析

2.1 喜樹高生長動(dòng)態(tài)變化

由圖1可以看出，1年生喜樹高生長呈現(xiàn)慢-快-慢的“S”型變化趨勢(shì)，即4～5月份高生長速率較慢，6月份高生長速率迅速增大，6月中旬～7月中旬高生長最快，生長速率最大值出現(xiàn)在7月中旬，此時(shí)苗高為46.39 cm，生長速率為0.816 0 cm/d，后喜樹生長速率逐漸降低，10月中旬后喜樹高生長迅速減慢，11月末喜樹高生長趨向停止。

圖1 1年生喜樹樹高動(dòng)態(tài)變化

2.2 喜樹粗生長（基徑）動(dòng)態(tài)變化

由圖2可以看出，1年生喜樹粗生長亦呈現(xiàn)慢-快-慢的“S”型變化趨勢(shì)，即4～5月份高生長速率較慢，6月份高生長速率迅速增大，6月中旬～7月中旬高生長最快，生長速率最大值出現(xiàn)在7月中旬，此時(shí)，苗基徑為5.55 mm，生長速率為0.121 7 mm/d，后喜樹粗生長速率逐漸降低，10月中旬后喜樹粗生長迅速減弱，11月末喜樹基徑粗生長趨向停止。

圖2 1年生喜樹基徑動(dòng)態(tài)變化

2.3 喜樹總生物量動(dòng)態(tài)變化

由圖3可以看出，1年生喜樹總生物量也呈現(xiàn)慢-快-慢的“S”型變化趨勢(shì)，即4～5月份總生物量增長速率較慢，6月份增長速率迅速增大，6月中旬～7月中旬生物量增長最快。

圖3 1年生喜樹生物量動(dòng)態(tài)變化

總生物最大值出現(xiàn)在7月中旬，此時(shí)總生物量為2.796 5 g/株，增長速率為0.070 3 g/d·株，后喜樹總生物量增長速率逐漸降低，10月中旬后喜樹總生物量增長迅速下降，11月末喜樹基徑粗生長趨向停止。

2.4 喜樹葉片中喜樹堿含量的季節(jié)性變化

由圖4可以看出，在喜樹1年生長過程中，嫩葉和成熟葉中喜樹堿含量均為單峰曲線。從4～7月份，嫩葉與成熟葉中喜樹堿含量均呈上升趨勢(shì)，其中嫩葉在7月中旬含量達(dá)到最大值，為0.912 9‰，成熟葉中喜樹堿含量亦在7月中旬達(dá)到最大值，為0.591 68‰。后嫩葉與成熟葉中喜樹堿含量均呈降低趨勢(shì)，嫩葉與成熟葉中喜樹堿含量均在11月份最低，分別為0.141 8‰和0.079 1‰。比較顯示，嫩葉與成熟葉中喜樹堿含量均在6月下旬、7月中旬含量最高，與其他月份相比差異顯著（P＜0.05）。主要原因是這個(gè)時(shí)期，光照、溫度、水分及其他生理生態(tài)因子均適宜喜樹生長，植物體內(nèi)各生理代謝活動(dòng)旺盛，合成的次生代謝產(chǎn)物喜樹堿的速率較快。此后CPT含量持續(xù)降低，至11月下旬，嫩葉與成熟葉中CPT含量明顯降低，并且較當(dāng)年4月中旬的含量低，而此時(shí)，喜樹體內(nèi)各生理代謝活動(dòng)亦相對(duì)穩(wěn)定并逐漸減弱。在整個(gè)生長期內(nèi)，嫩葉中CPT含量均高于同期成熟葉中的CPT含量，差異極顯著（P＜0.01）。喜樹葉片中喜樹堿含量與喜樹1年中的生長和生理活動(dòng)過程相關(guān)。

圖4 不同月份喜樹葉片中喜樹堿含量變化

2.5 喜樹不同葉齡葉片中喜樹堿含量變化

由圖5可以看出，葉片中CPT含量與葉齡（展開天數(shù)）呈負(fù)相關(guān)，葉齡愈小，喜樹堿含量愈高，葉齡愈大，CPT含量愈低。葉齡5天時(shí)，CPT含量出現(xiàn)最大值，為2.098 2‰，葉齡為10天的喜樹葉，CPT含量為1.983 9‰，后隨著葉片葉齡逐漸增大，CPT含量卻出現(xiàn)急劇降低的變化趨勢(shì)，當(dāng)葉齡為70天時(shí)，CPT含量最低，為0.092 3‰。

圖5 CPT含量-葉齡動(dòng)態(tài)變化

3 結(jié)論與討論

劉麗杰等[13]對(duì)處于不同發(fā)育階段的當(dāng)年生喜樹葉中CPT含量變化的研究發(fā)現(xiàn)，其成熟葉CPT含量在6月份達(dá)到最高值，此后逐漸減少，在8～9月份之間CPT含量略有增加。Liu等[26]研究結(jié)果顯示，喜樹葉片中CPT含量從4月至10月平均每月下降11%；張玉紅等[27]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，喜樹嫩葉中CPT含量為一單峰曲線，在7月份達(dá)到最高值。郭勇[28]等研究顯示，喜樹是嫩葉還是成熟葉，在生長期內(nèi)，其CPT含量變化均為雙峰曲線，分別在6月和9月達(dá)到峰值，其中以6月份CPT含量最高。張顯強(qiáng)等[15]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，喜樹葉片中的CPT含量4～5月份逐漸上升，6～11月，CPT含量均不高，且不斷下降。本研究喜樹生長期內(nèi)，無論是嫩葉還是成熟葉，CPT含量變化均為單峰曲線，且CPT含量變化與喜樹生理變化過程一致，這一研究結(jié)果與張玉紅[27]的研究結(jié)論相同，對(duì)于不同葉齡喜樹葉中喜樹堿含量，葉齡為5天的喜樹葉中含量最高，后逐漸降低，這與郭勇[28]的研究結(jié)論相同。研究表明，輕度遮蔭，喜樹葉片喜樹堿含量較全光照的有所提高[29-30]，適當(dāng)?shù)土酌{迫可以增加幼苗及葉片中喜樹堿含量[31]，不同土質(zhì)可影響喜樹幼苗生長及葉片中的喜樹堿含量，花土栽培較適合喜樹幼苗的生長和葉片中喜樹堿產(chǎn)量的提高[31]。

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