歐洲喬木花楸組織培養(yǎng)快速繁殖體系建立研究

朱 虹

（遼寧省干旱地區(qū)造林研究所，朝陽 122000）

歐洲喬木花楸（Sorbus aucuparia）屬薔薇科花楸屬落葉喬木，原產(chǎn)歐洲和亞洲西部。喜光稍耐蔭、喜涼爽濕潤的氣候。適應(yīng)于多種土壤類型，喜濕潤且排水較好的酸性或微酸性土壤。樹干端直，樹形魁梧，枝條伸展性好，冠幅呈卵圓形，樹形美觀。夏季葉色翠綠，秋季葉色為橙紅。花白色，果實橙色或紅色，扁球形，冬季宿存具四季皆宜的觀賞效果，可作庭院、公園、廣場、小區(qū)綠化，在歐洲已被廣泛應(yīng)用于園林綠化中。其果實中含有糖、維生素、黃酮、花青素等物質(zhì)，具有強抗氧化、抗癌、抗輻射、止咳平喘等藥用功效，具有極佳的市場前景。[1-3]

歐洲喬木花楸繁殖方法單一，繁殖速度慢，實生育苗種苗變異大，嫩枝扦插育苗成活率不到20%，且國內(nèi)目前還沒有形成較大規(guī)模的繁育基地。利用組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖歐洲喬木花楸可在短時間內(nèi)獲得大量優(yōu)質(zhì)種苗，本試驗結(jié)合歐洲喬木花楸生物學特性，利用組織培養(yǎng)技術(shù)，完善了歐洲喬木花楸組培技術(shù)流程，以期能為歐洲喬木花楸規(guī)模化栽培提供一定的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所選用的外植體是本所林地經(jīng)濟課題組歐洲喬木花楸培養(yǎng)圃內(nèi)當年新萌發(fā)歐洲喬木花楸帶側(cè)芽莖段。采集季節(jié)為5月末至6月中旬，采集時間為晴朗天氣的上午10點以后。以自配的MS為基本培養(yǎng)基，各試驗階段分別使用不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA、NAA、IBA。

1.2 研究方法

1.2.1 外植體的取得

外植體取材的季節(jié)、位置直接影響無菌體系的建立，需選取生長旺季，最具母株特性的一段植株或者其他部位。本試驗在5月末～6月中旬，在生長健壯的歐洲喬木花楸優(yōu)良母樹上剪取長勢良好的當年萌發(fā)新梢作為外植體材料，剪下枝條后去除葉片，留取有用莖段，修剪好的莖段，按老嫩程度差別的不同分別放在不同的容器內(nèi)，便于后期清洗與消毒的時間把握。

1.2.2 外植體的清洗與滅菌

將老嫩程度不同的供試外植體材料分別切成約10 cm的小段，放在洗衣粉溶液中不斷搖晃，充分清洗，去除表面灰塵雜質(zhì)，如灰塵雜質(zhì)太多，可用潔凈的軟毛刷仔細刷洗干凈，但要注意不要碰壞嫩芽。用洗衣粉清洗完后，將外植體放在水流下沖洗干凈，不要殘留泡沫。沖洗干凈后的莖段放入傳遞窗中，置于接種室備用。轉(zhuǎn)接前先用75%酒精將外植體材料消毒30 s，無菌水沖洗2～3次，再根據(jù)莖段老嫩程度不同，放在0.1%升汞溶液中浸泡4～8 min，然后用無菌水沖洗5～6次，每次沖洗2～3 min，沖洗凈升汞溶液后放入超凈工作臺中準備接種。

1.2.3 培養(yǎng)基的配制及培養(yǎng)條件

試驗腋芽誘導及分化增殖采用MS為基本培養(yǎng)基，生根采用1/2MS為基本培養(yǎng)基，蔗糖濃度為3%，瓊脂含量0.8%，用HCl或NaOH調(diào)解pH至5.5～5.8，在高溫滅菌前為各階段培養(yǎng)基分別加入不同質(zhì)量的6-BA、NAA、IBA等植物生長調(diào)節(jié)劑，高壓滅菌條件為121℃20 min。培養(yǎng)室溫度為（25±3）℃，光照強度 3 000 lx，光周期為 16 h/d。

1.2.4 芽誘導

將清洗、消毒后獲得的無菌外植體材料在超凈工作臺中切成2～3 cm的帶2～3個腋芽的小莖段，接種到不同處理組合組成的培養(yǎng)基中（表1）。6-BA采用3個濃度處理，分別為1.0、1.5、2.0 mg/L；NAA 3 個濃度處理，分別為 0.6、0.8、1.0 mg/L。每處理各接種60瓶，每瓶接種1個外植體材料，觀察并記錄叢生芽誘導情況，35天后統(tǒng)計萌芽數(shù)、萌芽率（萌芽率=萌芽數(shù)/接種外植體株數(shù)×100%）、生長情況。

表1 歐洲喬木花楸腋芽誘導培養(yǎng)基配方設(shè)計

1.2.5 繼代增殖

將初代培養(yǎng)產(chǎn)生的芽轉(zhuǎn)接到繼代增殖培養(yǎng)基中（表2），6-BA采用3個濃度處理，分別為1.0、2.0、2.5 mg/L；NAA 3個濃度處理，分別為 0.2、0.4、0.6 mg/L，每處理各接種20瓶，每瓶接種4個芽。35天后統(tǒng)計增殖系數(shù)（增殖系數(shù)即單個外植體再生形成的芽的平均數(shù)）與生長情況。

1.2.6 生根培養(yǎng)

將獲得的不定芽切成長2～3 cm，留2～3片葉片的小段接種到生根培養(yǎng)基中（表3），IBA采用3 個濃度處理，分別為 0、0.4、0.8 mg/L；NAA 3 個濃度處理，分別為0、0.6、0.8 mg/L，每處理各接種20瓶，每瓶接種4株。30天后統(tǒng)計生根率（生根率=生根株數(shù)/接種株數(shù)）、根數(shù)、根長、株高，篩選出最佳生根培養(yǎng)基配方。

表2 歐洲喬木花楸繼代增殖培養(yǎng)基配方設(shè)計

表3 歐洲喬木花楸生根培養(yǎng)基配方設(shè)計

1.2.7 移栽

本試驗將在生根培養(yǎng)中培養(yǎng)30天后，單苗長出潔白的正常的短根，苗高4～5 cm的歐洲喬木花楸組培生根苗在溫室大棚進行日光鍛煉后，移栽至沙子、熟表土、草炭土按不同比例充分混勻并已消毒的移栽基質(zhì)中，對移栽在大棚中的小苗要時刻根據(jù)溫度、濕度、光照的變化及時噴水，保濕、控溫、施肥、防病害，盡可能地創(chuàng)造適宜的生存環(huán)境，促進試管苗緩苗，提高成活率。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 芽誘導

將消毒滅菌后的外植體分別接入到編號為1～9的培養(yǎng)基中，7天時即可見到培養(yǎng)基中的外植體有芽萌動；10天后4號、6號培養(yǎng)基中的外植體開始分化出小葉片；15天后其他培養(yǎng)基中的外植體開始分化出小葉片。由表4可知，9種處理組合培養(yǎng)基均能促進歐洲喬木花楸初代外植體萌芽，在4號培養(yǎng)基中的腋芽誘導效果最好，反應(yīng)快，長勢強，葉片平展，誘導率達68.33%。在5號培養(yǎng)基中的腋芽誘導可達65%，易落葉導致植株死亡。其他處理培養(yǎng)基中的外植體長勢均不理想，因此歐洲喬木花楸最適誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.6 mg/L。

表4 不同激素濃度對歐洲喬木花楸腋芽誘導的影響

2.2 繼代增殖

將歐洲喬木花楸的帶芽莖段轉(zhuǎn)接到編號10～18的繼代增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度的植物調(diào)節(jié)劑6-BA和NAA，培養(yǎng)35天后統(tǒng)計增殖系數(shù)和生長情況。由表5可知，在添加了6-BA2.0 mg/L和NAA0.2 mg/L的14號培養(yǎng)基中的不定芽增殖系數(shù)為5.23，雖稍低于16號培養(yǎng)基歐洲喬木化楸的增殖系數(shù)，但長勢好、苗粗壯，苗高5.26 cm，高于其他處理。16號培養(yǎng)基中的不定芽增殖系數(shù)雖最高，為5.35，但苗細弱、葉黃化、脫落，不適合進行下一步的生根培養(yǎng)，因此繼代增殖的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.4 mg/L。

表5 不同激素濃度對歐洲喬木花楸繼代增殖的影響

2.3 生根

歐洲喬木花楸生根所需植物調(diào)節(jié)劑為IBA和NAA，以1/2MS為基本培養(yǎng)基，IBA和NAA進行不同濃度、配比處理組合，30天后統(tǒng)計生根情況（表6）。9種處理組合的培養(yǎng)基均可誘導根的發(fā)生，IBA和NAA均對根的發(fā)生有促進作用，但二者配合使用效果更好，在促進生根、提高生根率的同時，還能促進苗的生長。添加了IBA0.4 mg/L、NAA 0.6 mg/L的23號培養(yǎng)基中的培養(yǎng)苗長勢壯、葉片平展、濃綠，主根粗壯、須根較多，平均生根率達95.6%。所以，歐洲喬木花楸最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.4+NAA0.6。

表6 不同激素濃度對歐洲喬木花楸生根的影響

2.4 移栽

經(jīng)過誘導啟動和繼代增殖在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天后，歐洲喬木花楸試管苗已生根成為完整的再生植株，這時可出瓶移栽。移栽過程中要根據(jù)當?shù)氐臍夂颦h(huán)境特點、移栽季節(jié)、設(shè)備條件，分析并改善幼苗的種植環(huán)境，使其能有一個逐步鍛煉和適應(yīng)的過程。這就要求在移栽時要選擇適宜的介質(zhì)，移栽后保持小苗的水分供需平衡，給予適宜的光照、溫度管理。

2.4.1 苗木移栽前馴化煉苗

將歐洲喬木花楸組培苗從培養(yǎng)室內(nèi)取出，放在煉苗溫室大棚內(nèi)閉瓶煉苗10～20天，遮蔭度為50%～70%，然后打開瓶口，逐漸降低濕度，并逐漸增強光強，通過馴化，新葉逐漸形成蠟質(zhì)、產(chǎn)生皮毛，恢復(fù)氣孔功能，適應(yīng)環(huán)境5～7天后即可移栽。

2.4.2 苗木移栽

苗木移栽應(yīng)在早、晚或陰天進行。用鑷子將組培苗取出，放入清水盆中洗凈根部瓊脂，將根系在1 000倍的多菌靈溶液中消毒處理，消毒后用清水漂洗。移栽時動作要輕，不能損傷根系和莖，以免引起污染。移栽不可過深，埋住根系即可。隨栽隨用噴霧器噴水保濕，移栽后的組培苗要搭建塑料拱棚以便控溫、保濕。

2.4.3 移栽基質(zhì)

疏松通氣、透水保濕是組培苗對基質(zhì)的基本要求。生產(chǎn)上常用的移栽基質(zhì)有園田土、草炭土、細河沙，或者將它們以一定比例混合應(yīng)用。基質(zhì)要混勻過篩，移栽前基質(zhì)要進行滅菌處理，移栽苗管理過程中在保證高濕度前提下，基質(zhì)不可澆水過多，以利根系的呼吸，促進生根成活。對移栽苗進行最適移栽基質(zhì)試驗發(fā)現(xiàn)，移栽在混合基質(zhì)沙子∶熟表土∶草炭土=3∶4∶3中的歐洲喬木花楸成活率可達91%以上，成活率最高，為最適移栽培養(yǎng)基。

2.4.4 水分管理

歐洲喬木花楸組培苗在出瓶前是在100%相對濕度條件下生長的，莖葉表面幾乎沒有防止水分散失的角質(zhì)層，并且根系不發(fā)達，種植后難以保持水分平衡，尤其是剛移栽3～7天時組培苗對水分十分敏感。采取移栽后淋透水、加蓋塑料拱棚保濕、用噴霧器往葉面噴灑清水等措施減少葉面蒸騰，使拱棚內(nèi)的空氣濕度保持在95%以上，盡量接近培養(yǎng)瓶中的條件，7天后成活的組培苗開始生根，此時要逐漸減少葉面噴水次數(shù)，延長每天塑料拱棚的打開時間，恢復(fù)氣孔調(diào)節(jié)功能，逐漸適應(yīng)移栽環(huán)境。

2.4.5 光照與溫度

根據(jù)試驗，將歐洲喬木花楸在4月末至5月中旬移栽至溫室大棚，加蓋塑料小拱棚，移栽基質(zhì)溫度保持在15℃以上，移栽后應(yīng)注意遮光控溫，白天溫度控制在（25±5）℃，夜間溫度控制在（15±5）℃，保證苗木生長所需溫度，遇到連續(xù)低溫氣候，適當延長塑料薄膜覆蓋時間，溫度高于30℃時，應(yīng)打開拱棚或噴灑清水降溫。移栽后的容器苗要避免陽光直射，采用散射光，或在遮陰條件下進行，一般可用70%黑色遮陽網(wǎng)，擋住直射光，避免傷苗。1周后，移栽苗成活并長出新根，此時可逐漸撤掉遮陽網(wǎng)，將日光逐漸增強到50%～60%，促進苗木木質(zhì)化程度，到了生長后期要全光照，成活率一般都可達到90%以上。

3 結(jié)論與討論

本試驗立足于歐洲喬木花楸工廠化育苗，選取歐洲喬木花楸當年生新萌發(fā)的帶側(cè)芽莖段為外植體，篩選出腋芽誘導、繼代增殖及生根的最適培養(yǎng)基，歐洲喬木花楸誘導培養(yǎng)與分化增殖培養(yǎng)階段對外源生長調(diào)節(jié)劑比較敏感，6-BA與NAA配合使用效果最好。最佳誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.6 mg/L，誘導率達68.33%；最佳繼代增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.4 mg/L，繼代增殖系數(shù)為5.23。在生根階段，IBA與NAA配合使用的生根效果優(yōu)于單獨使用NAA，1/2MS+IBA0.4 mg/L+NAA0.6 mg/L為歐洲喬木花楸最佳生根培養(yǎng)基，生根率達95.6%。移栽過程中通過選擇疏松透氣的移栽基質(zhì)、移栽后加強水分、溫度、光照管理使其逐漸由異養(yǎng)狀態(tài)過渡到自養(yǎng)狀態(tài)，提高煉苗移栽成活率，成活率一般都可達到90%以上。歐洲喬木花楸組織培養(yǎng)快速繁殖體系的建立，為歐洲喬木花楸種質(zhì)資源保護及快速繁殖開辟了新的途徑，可從根本上解決歐洲喬木花楸引種數(shù)量少、繁殖困難等問題，為良種苗木的快繁擴繁奠定了堅實基礎(chǔ)。

［1］ 譚文澄,戴策剛.觀賞植物組織培養(yǎng)技術(shù)［M］.北京：中國林業(yè)出版社,1999.

［2］ 黃立華,王占龍,朱虹,等.紅醋栗組培快繁技術(shù)研究［J］.遼寧林業(yè)科技,2012(2):15-17.

［3］ 楊玲,劉虹男,張冬平,等.紫葉白樺組培苗葉片花青素含量影響因素分析［J］.森林工程,2017,33(2):33-40.