制備型高效液相色譜法分離純化綠原酸

王彩杰

摘要：綠原酸是植物在有氧呼吸過程中形成的一種苯丙素類物質(zhì)，是由咖啡酸與奎尼酸組成的縮酚酸，是金銀花、杜仲、淡竹葉等中草藥的主要有效成分之一。高效液相色譜是利用高壓輸液泵驅(qū)使流動相通過裝填固定相的色譜柱，按照固液相之間的分配機(jī)制對混合物進(jìn)行分離的方法。文章主要運(yùn)用高效液相色譜法來對杜仲葉中的綠原酸進(jìn)行分離純化。

關(guān)鍵詞：杜仲葉；綠原酸；FLEXA系列制備液相色譜儀；分離純化

杜仲是我國特有的木本植物，是一種名貴的中藥材。傳統(tǒng)上以杜仲皮入藥，但近年來的研究結(jié)果表明，杜仲葉和皮成分基本相同，特別是杜仲葉中綠原酸和黃酮的含量遠(yuǎn)高于皮中的含量。綠原酸（Chlorogenic acid）是植物在有氧呼吸過程中形成的一種苯丙素類物質(zhì)，具有利膽、抗菌、降壓、增高白血球及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥用功能。綠原酸在植物界廣泛存在，但含量較高的植物不多。近年來的研究表明，杜仲葉中綠原酸含量較為豐富，達(dá)3.6%～5.5%。因此分離純化杜仲葉中的綠原酸十分必要。

1杜仲葉的藥理特性概述

杜仲為杜仲科杜仲屬植物，《中國藥典》記載其有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎等功效，用于肝腎不足、腰膝酸痛、筋骨無力、頭暈口眩、妊娠漏血、胎動不安川。我國杜仲資源豐富，研究利用歷史悠久，傳統(tǒng)上杜仲主要以皮入藥，樹齡需達(dá)到一定年限方可剝皮，然而杜仲樹干剝皮后需間隔3-4年后方可再次剝皮，而且剝皮后杜仲樹若養(yǎng)護(hù)措施不足，極易造成皮剝樹死，從而對杜仲資源造成極大浪費(fèi)，嚴(yán)重影響杜仲資源的可持續(xù)發(fā)展。杜仲葉為每年夏秋兩季杜仲樹枝繁葉茂時采摘，經(jīng)干燥后所得。研究表明，杜仲葉與杜仲樹皮活性成分基本一致，藥理作用基本相同。相較于杜仲皮，杜仲葉具有來源豐富、再生循環(huán)能力強(qiáng)、合理采摘對杜仲資源不會造成破壞等特點(diǎn)。研究表明，杜仲葉所含的有效活性成分主要包括黃酮類、綠原酸、環(huán)烯醚砧類、多糖類、多酚類、苯丙索類、木脂索類等化合物。藥理研究結(jié)果表明，杜仲葉具有降血壓、調(diào)節(jié)血脂、防治骨質(zhì)疏松、降血糖、鎮(zhèn)靜安神、抗疲勞等作用，在食品、醫(yī)藥行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用價值。

2杜仲葉中所含綠原酸的研究現(xiàn)狀

綠原酸屬于苯丙索類化合物，廣泛存在于金銀花、牛薯葉、向日葵、雪蓮果、蒲公英等植物中，杜仲葉中也含有豐富的綠原酸，含量一般可達(dá)1%-5%，為杜仲葉主要有效成分之一。綠原酸具有較好的抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等生理功能，因而在保健食品和醫(yī)藥行業(yè)具有很廣泛的應(yīng)用。我國杜仲葉分布廣泛，產(chǎn)量巨大，且多為野生，是非常好的綠原酸原料來源，以杜仲葉為原料制備綠原酸具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢。李旭等對微波輔助提取杜仲葉中綠原酸的工藝進(jìn)行了研究，響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝結(jié)果表明，杜仲葉粉碎至80目，以30%乙醇為提取溶劑，料液比為1：26（g：mL），微波功率為722W時，提取2.5min，綠原酸提取量可達(dá)29.74mau/g。與醇提相比，水提則相對方法簡單，經(jīng)濟(jì)節(jié)約，葉宏等以水為溶劑提取杜仲葉中的綠原酸，提取率可達(dá)95%。杜仲葉在我國分布廣泛，杜仲葉中綠原酸地域差異明顯。除地域差異外，采收期、杜仲樹齡、干燥方法以及儲存時間均對杜仲葉中綠原酸含量有較大影響。

3杜仲葉中綠原酸的分離純化實(shí)驗(yàn)

3.1儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器為：FLEXA系列制備液相色譜儀（自組）、200-400nm雙波長檢測器、ATS-051-H25高壓自動進(jìn)樣器和7725I分析型手動六通進(jìn)樣閥等。對照品為中國藥品生物制品檢定所提供的綠原酸。樣品來源于本實(shí)驗(yàn)室從杜仲葉中提取純化而得的綠原酸晶體。實(shí)驗(yàn)試劑為：甲醇，分析純，有機(jī)酸A，B，C和D，分析純；有機(jī)酸E，分析純（試劑配制后用0.45μm微孔濾膜過濾）；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)樣品；綠原酸粗品（由杜仲葉水提醇沉，再經(jīng)大孔吸附樹脂純化后得到）；水（為二次蒸餾水）。

3.2色譜條件

ODS色譜柱（國產(chǎn)不銹鋼柱，直徑×長80mm×500mm，C18粒徑為20～40μm）；流動相為醇B-水-酸（體積比為15∶85∶0.1）；流速梯度洗脫；檢測波長為254nm；進(jìn)樣量為10mL。色譜條件為[13]：YWG-C18色譜柱（直徑×長為6mm×150mm，C18粒徑為5μm）；流動相為乙腈-水-乙酸（體積比為10∶88∶2）；流速為1 mL/min；柱溫為25℃；衰減為3；紙速為3mm/min；測定波長為326nm；進(jìn)樣體積為6μL。

3.3綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取綠原酸對照品適量，用流動相溶液溶解并稀釋到1 000μg/ml，得標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（宜儲存于棕色容量瓶中）。精密量取儲備液適量，用流動相配成含綠原酸分別為20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次進(jìn)樣20μl進(jìn)行測定。

3.4綠原酸樣品的制備及測定

3.4.1樣品的制備

將陰干的杜仲葉放入提取罐中，加入適量的去離子水，在室溫下采用超聲波預(yù)處理后，用SZTC天然沉降劑代替醇沉工藝，以除去蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)、樹脂、果酸等大分子物質(zhì)；然后再利用超濾膜分離技術(shù)處理提取液（這時固溶物綠原酸含量可達(dá)10%左右）；最后采用有機(jī)溶劑分離純化，減壓回收溶劑，干燥后得樣品。

3.4.2樣品綠原酸的測定

精確稱量樣品10mg左右，加流動相溶液溶解，定容到50ml，用超聲波脫氣，過濾后進(jìn)樣20μl，測定樣品的峰面積，根據(jù)上述回歸方程對樣品進(jìn)行含量測定。

3.5回收率試驗(yàn)

取5份樣品，分別加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后進(jìn)行測定，其結(jié)果為平均回收率98.45%，CV-1.37%。精密度試驗(yàn)：將樣品分別進(jìn)樣5次，其峰面積分別為：263 348、262 533、263 255、263 389、264 123。

4結(jié) 論

4.1測定結(jié)果

根據(jù)上述方法測定，本室分離提純的杜仲綠原酸含量達(dá)74.74%。

4.2提取溶劑的選擇

對杜仲葉中提取綠原酸的溶劑研究表明，用70%以上的醇提取，雖然綠原酸的得率和含量都較高，但總提物較多、色重，且乙醇損耗大，給后續(xù)的分離純化帶來困難；用水提取，綠原酸得率雖然較低，但提出物較少，綠原酸含量仍然較高，且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，所以采用水溶劑。但是，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，如果水的硬度太大，提取效果也不是很好，最終我們選用去離子水為提取溶劑。

4.3超聲波提取法

該法具有節(jié)能、節(jié)時、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，其原理是：超聲波發(fā)生器在提取罐體內(nèi)共振產(chǎn)生大量高壓微氣穴，附著在提取物表面，瞬時破裂時，幾千大氣壓瞬時擊破細(xì)胞壁，使植物細(xì)胞破裂，從而加快和提高杜仲綠原酸等有效成分的溶出。

4.4控制pH值

水提時要注意控制好溶液的pH值，使之呈弱酸性并且要防止高溫。這是因?yàn)榫G原酸具有鄰苯二酚及羧基結(jié)構(gòu)，常以鹽的形式存在于植物體中，且它的穩(wěn)定性及存在狀態(tài)與溶液的pH值有關(guān)。另外在高溫條件下，綠原酸容易分解、氧化。

綜述所述，杜仲作為我國特有的樹種，分布廣泛，相較于杜仲樹皮，杜仲葉屬于可再生資源，產(chǎn)量巨大，加緊對杜仲葉的研究和開發(fā)應(yīng)用必將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。綠原酸具有抗菌、抗病毒、利膽、增高白血球及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗氧化、抑制高血壓等功效。文章采用反相高效液相制備系統(tǒng)，以乙醇-水和少量羧酸為流動相，制備了CGA，并結(jié)合高效液相色譜分析法，可得到純度為74.74%的CGA產(chǎn)品。

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