分枝桿菌原生質體誘變產9—羥基—雄烯二酮菌種選育

薛凱+王榮+王友富+李良智+胡翠英+扶教龍

摘要：為獲得轉化底物植物甾醇為9-羥基-雄烯二酮（簡稱9-OH-AD）的高產穩定菌株，將出發菌株分枝桿菌制備成原生質體，并對其原生質體進行定向紫外誘變篩選。結果表明，NaCl為最佳的分枝桿菌原生質體滲透穩定劑，最適濃度為0.5 mol/L，在此條件下獲得的原生質體數量為3.1×108個/mL，且最終獲得1株比出發菌株9-OH-AD生產量提高84.7%的菌株MS23，經傳代3次，9-OH-AD的積累量分別為37.32、41.64、38.77 mg/L，具有良好的遺傳穩定性。產品通過液相色譜進行確證，同時在5 L發酵罐中進行轉化制備9-OH-AD的初步研究。經原生質體紫外誘變獲得的遺傳性穩定的9-OH-AD高產菌株可用于進一步的轉化制備條件優化研究。

關鍵詞：分枝桿菌；原生質體誘變；9-OH-AD；菌種選育；液相色譜

中圖分類號： S182文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）23-0288-04

收稿日期：2016-09-16

國內外以甾醇為原料、利用分枝桿菌等微生物轉化生產9-OH-AD已成為研究熱點。例如Shtratnikova等已測出能夠轉化植物甾醇為9-OH-AD的分枝桿菌VKM Ac-1817D的完整基因序列[4]；姚抗深入研究了微生物降解甾醇中與 9-OH-AD的合成和降解相關的2個關鍵酶（3-甾酮-9α-羥基化酶與3-甾酮-Δ1-脫氫酶）[5]；袁家代等通過構建kshA和kshB基因共表達的重組菌對3-甾酮-9α-羥基化酶編碼基因進行異源表達，成功對分枝桿菌生物轉化特性進行了改造，制備獲得了9-OH-AD[6]；范書玥等從土壤中篩選出具備甾醇降解能力的分枝桿菌（Mycobacterium sp. NwIB-01），對該菌的3-甾酮-9α-羥基化酶進行了基因克隆、異源表達與分離純化，為進一步利用基因工程手段改造分枝桿菌菌株，提高其轉化甾醇的能力從而為利用基因工程菌進行工業化生產9-OH-AD等奠定了基礎[7-8]。此外，Sukhodolskaya等研究表明，主產9-OH-AD的同時由于殘余的3-甾酮-Δ1-脫氫酶的存在，也會有部分的降解發生[9]。因此，田琳等通過同源重組用體外突變失活的3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因代替分枝桿菌染色體上正常的3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因，導致整個3-甾酮-Δ1-脫氫酶基因失活，以讓3-甾酮-Δ1-脫氫酶無法表達，從而使9-OH-AD得以積累[10]。另一方面，9-OH-AD的生產存在甾醇水溶性差、傳質效率低、底物毒害、產物抑制以及產物降解等問題，許多研究者也做了大量相關的研究[11-14]。總體而言，國內外尚無生物法制備9-OH-AD的工業生產，篩選并獲得制備9-OH-AD的高效菌株具有重要的工業意義。

為此，本研究對實驗室已有的分枝桿菌進行原生質體紫外誘變系統研究，確定分枝桿菌原生質體的制備條件，并比較篩選得到的菌株制備生產9-OH-AD的能力，獲得1株生產轉化能力較好的菌株，最后用該菌株在5-L生物反應器中進行轉化制備9-OH-AD的初步研究。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗菌株出發菌株分枝桿菌（Mycobacterium sp.）于筆者所在實驗室4 ℃冰箱中斜面保藏。

1.1.2試劑植物甾醇，由浙江省神洲藥業有限公司提供；玉米漿，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；溶菌酶，購自國藥集團化學試劑有限公司；酵母粉為生化試劑；甘油、K2HPO4、MgSO4·7H2O、NH4Cl、NaNO3、（NH4）2HPO4、無水乙醇、Na2HPO4、NaH2PO4、乙二胺四乙酸（EDTA）、NaCl、KCl、MgSO4、蔗糖、甘露醇、乙酸乙酯等試劑均為分析純。

預處理液：0.8% EDTA、0.1%巰基乙醇，用pH值為6.0的磷酸緩沖液配制。

原生質體滲透穩定劑：0.5 mol/L蔗糖、10.0 mmol/L MgCl2，用pH值為6.0的磷酸緩沖液溶解。

分枝桿菌去壁酶液：含質量分數為1%的溶菌酶的原生質體滲透穩定劑，微孔濾膜過濾除菌。

1.1.3儀器SPX-250BSH-II生化培養箱（上海新苗醫療器械制造有限公司）；高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；BIOTECH-5JG-7000A 5 L發酵罐（上海保興生物設備工程有限公司）；PHS-3TC pH電極（上海天達儀器有限公司）；YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器滅菌鍋（上海博迅實業有限公司）；TS2102搖床（上海天呈實驗儀器制造有限公司）；SW-CJ-2FD超凈工作臺（上海博迅實業有限公司）；SA224S電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]、TGL-20M離心機（上海盧湘離心機儀器有限公司）。

1.1.4培養基固體/斜面培養基：酵母粉5.0 g/L、甘油10.0 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、氯化銨1.0 g/L、瓊脂20.0 g/L，pH值為7.4。

種子培養基：葡萄糖6.0 g/L、甘油2.0 g/L、硝酸鈉 5.4 g/L，磷酸氫二銨0.6 g/L，酵母粉 15.0 g/L，pH值為 7.5～8.0。

發酵培養基：玉米漿20.0 g/L，硝酸鈉5.4 g/L，磷酸氫二銨0.6 g/L，無水乙醇10.0 mL/L，植物甾醇5.0 g/L，pH值為8.0～8.5。

再生高滲培養基：酵母粉5.0 g/L，甘油10.0 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，氯化銨1.0 g/L，蔗糖 0.8 mol/L，瓊脂20.0 g/L，pH值為7.4。

1.2試驗方法

1.2.1原生質體滲透穩定劑的選擇分別配制NaCl、KCl、MgSO4、蔗糖、甘露醇濃度為0.7 mol/L的再生高滲培養基，將誘變菌株分別涂于各再生高滲培養基上，每個處理3個平行，于30 ℃恒溫生化培養箱中培養7 d后，根據高滲培養基中原生質體的制備數確定最佳原生質體滲透穩定劑。endprint

1.2.2原生質體滲透穩定劑NaCl濃度的確定配制NaCl濃度分別為0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mol/L的再生高滲培養基，將誘變菌株分別涂于各濃度再生高滲培養基上，每個濃度3個平行，于30 ℃恒溫生化培養箱中培養7 d后，根據各高滲培養基中原生質體的制備數確定最適NaCl濃度。

1.2.3細胞懸液制備及原生質體的制備與再生用接種環在斜面培養基上刮取1環菌體，接種于種子培養基上，于 30 ℃、200 r/min搖床上振蕩培養48 h后，取 10 mL 種子液，4 000 r/min 離心10 min，用滲透壓穩定劑洗滌2次，將菌體懸浮于10 mL滲透壓穩定劑中制備成細胞懸液。取1 mL細胞懸液稀釋至10-6，用平板菌落計數法測細胞懸液濃度。原生質體誘變參考相關文獻[15]并加以改進。取5 mL細胞懸液，4 000 r/min 離心10 min，棄上清液，加入5 mL預處理液，靜置15 min，用滲透壓穩定劑洗滌2 次，離心10 min棄上清液，然后加入5 mL 1%溶菌酶液，30 ℃振蕩保溫2 h，2 000 r/min 離心10 min后，加入5 mL滲透穩定劑懸浮原生質體。取 0.5 mL 原生質體懸液，加入4.5 mL滲透穩定劑稀釋至10-6，涂布于再生高滲培養基培養計數。另取0.5 mL原生質體懸液，加入4.5 mL無菌水，稀釋至10-6后，用固體培養基培養計數。

1.2.4紫外誘變將制備好的原生質體用滲透壓穩定劑稀釋至10-6，取0.2 mL涂布于再生高滲培養基表面，置于已預熱30 min 20 W紫外燈下，照射距離為30 cm。磁力攪拌下分別照射20、40、60、80、100、120、140、160、180 s，每個時間3個平行，30 ℃下倒置遮光培養1周。觀察菌落形態，統計平板中的菌落數量，計算致死率，以未經誘變處理的菌懸液涂布平板作對照。

1.2.5固體斜面培養將菌株活化擴培于30 ℃恒溫生化培養箱中培養3～4 d，紫外誘變再生滲透培養基中菌株生長培養7 d。

1.2.6搖瓶轉化試驗挑取1環菌種接種于裝發酵培養基50 mL的250 mL搖瓶中進行種子液培養，在30 ℃、200 r/min搖床上培養3 d后，取5 mL種子液接入裝有0.25 g甾醇的 50 mL 發酵液中，于30 ℃、200 r/min搖瓶中培養轉化植物甾醇制備9-OH-AD，培養時間為120 h。

1.2.75-L發酵罐轉化試驗將活化培養3 d的種子液按10%接種量接至裝有12.5 g甾醇的2.5 L發酵培養基中，于30 ℃、400 r/min培養，pH值維持在8.2～8.7。每隔12 h取1次樣，測樣品中9-OH-AD的濃度。

1.2.8高效液相色譜（HPLC）分析方法轉化120 h后，按體積比1 ∶1加入乙酸乙酯，于30 ℃、200 r/min提取30 min后，4 000 r/min 離心10 min，取乙酸乙酯有機相層，用 0.22 μm 有機膜過濾后超聲脫氣進行高效液相色譜測定。色譜條件：二極管陣列檢測器（DAD檢測器），波長254 nm；色譜柱為Thermo：ODS-2 HYPERSIL（5 μm×250 mm×4.6 mm）；柱溫40 ℃；流動相 ∶甲醇與水體積比為 7 ∶3，流速1 mL/min，進樣量為30 μL。

2結果與分析

2.1原生質體滲透穩定劑的選擇

在再生高滲培養基配制中分別選用5種濃度為 0.7 mol/L 的滲透壓穩定劑，考察這些穩定劑對分枝桿菌原生質體制備的影響。由圖1可知，以KCl和蔗糖作為原生質體滲透壓穩定劑對原生質體制備效果的影響較小，而以NaCl作為滲透穩定劑的再生高滲培養基中所制備的原生質體數量較其他4種高，達到5.85×108 個/mL。其原因主要在于NaCl可能更符合菌體的外界液體環境，菌體外圍的Na+與菌體的滲透壓有關，能夠更好地維持菌體的滲透壓使原生質體不被外界破壞且能促進細胞壁的生成，從而獲得較多的原生質體。因此，本研究選用NaCl作為分枝桿菌原生質體的滲透壓穩定劑來進行原生質體的制備。

2.2原生質體滲透穩定劑NaCl濃度的確定

在再生高滲培養基中加入不同濃度的NaCl溶液，考察其對分枝桿菌原生質體數量的影響。由圖2可知，當NaCl濃度為0.5 mol/L時原生質體個數達到最大值，為3.1×108個/mL。隨著NaCl濃度的進一步增大，原生質體的數量逐漸減少，原因可能是NaCl濃度為0.5 mol/L時使原生質體的滲透壓恰好與外界液體環境平衡，這個濃度能夠維持細胞穩定并促進細胞壁的生成，隨著NaCl濃度的增大，外界液體環境的滲透壓易使原生質體脫水死亡從而導致原生質體制備率降低。

2.3原生質體制備率和再生率

由表1可知，通過公式原生質體制備率=（酶解前菌落數-固體培養基上菌落數）/酶解前菌落數×100%，原生質體再生率=（再生高滲固體培養基上菌落數-固體培養基上菌落數）/（酶解前菌落數-固體培養基上菌落數）×100%計算得原生質體的制備率和再生率分別為98.3%、52.6%。表明以0.5 mol/L NaCl作為滲透壓穩定劑，分枝桿菌原生質體在經紫外誘變后可獲得較高的原生質體制備率和再生率。

2.4菌株生長曲線及誘變條件確定

2.4.1分枝桿菌生長曲線將分枝桿菌用接種環接于裝有 50 mL 種子液的250 mL搖瓶中，于30 ℃、200 r/min搖床中培養，每隔6 h測定菌液600 nm處的吸光度。由圖3可知，分枝桿菌在0～48 h時處于停滯期，在48～96 h期間為對數期，96 h之后步入平穩期。48～96 h的對數期是分枝桿菌生長代謝最旺盛的時期，也是分枝桿菌對外界環境最敏感的時期，在此時間段對其進行誘變處理易獲得理想突變株。endprint

2.4.2紫外誘變對菌株的致死率由圖4可知，致死率隨紫外照射時間的延長而增加，140 s左右達到99%，之后基本穩定。當紫外照射時間為60～74 s時，致死率為70%～80%，此時回復突變株的出現率較低，因此確定紫外誘變的最佳時間為65 s。

2.5突變菌株搖瓶轉化制備9-OH-AD分析

經過紫外誘變篩選獲得了143株突變株，挑取其中的63株進行初篩，經過初篩后獲得11株轉化積累9-OH-AD效果優于出發菌株的突變株。由表2可知，菌株MS5的 9-OH-AD積累量為 62.31 mg/L，與出發菌株相比，提高了134.25%。11株菌株中，MS13菌株的9-OH-AD積累量最低，但與出發菌株相比提高了32.89%。對11株菌株進行復篩和遺傳穩定性研究，各菌株傳代3次產9-OH-AD的結果如圖5所示，MS23菌株經過3次連續傳代，其9-OH-AD積累量基本保持穩定，3次傳代后其9-OH-AD產量分別為37.32、41.64、38.77 mg/L，表明該菌株相對來說具有良好的遺傳穩定性。采用HPLC對所得到的發酵液樣品進行液相色譜分析。由圖6可知，出發菌株、突變菌株、9-OH-AD標準品均在3.03 min出現吸收峰，說明所獲得的樣品在這一時間點出現的吸收峰即為9-OH-AD的峰，所獲得的MS23突變菌株轉化制備獲得的對應產物為9-OH-AD。

表2出發菌株及突變株搖瓶培養轉化制備9-OH-AD的情況

菌株9-OH-AD積累量（mg/L）出發菌株26.60MS237.88MS338.14MS562.31MS1135.46MS1335.35MS1942.25MS2349.13MS2746.16MS2835.57MS3039.92MS5258.22

2.65 L發酵罐中高產菌株MS23轉化制備9-OH-AD分析

考察菌株MS23在5 L發酵罐中轉化底物甾醇為9-OH-AD的情況。由圖7可知，在0～102 h，9-OH-AD的產量增加不明顯，而到102 h時，9-OH-AD的產量進入對數期式的增長，在124 h時達到50.41 mg/L，可能是由于在菌體轉化底物植物甾醇代謝途徑中產生了能夠促進3-甾酮-9α- 羥基化酶活性的代謝物， 使得9-OH-AD的合成進程

加速從而導致9-OH-AD積累量的對數式增長[16]。124 h之后9-OH-AD的產量逐漸減少，由124 h時的50.41 mg/L在143 h時降為48.66 mg/L，可能由于C1，2位脫氫酶的作用效果在124 h后開始大于3-甾酮-9α-羥基化酶，使得9-OH-AD的母核得以降解從而進一步水解導致9-OH-AD的產量減少[17-18]。總之，發酵罐中生物轉化制備9-OH-AD，其積累量與搖瓶轉化相比提高了2.61%，今后將進一步通過控制發酵罐中轉速、溫度、pH值及添加甾醇底物的促溶劑等其他發酵條件來提高9-OH-AD的產量。

3結論與討論

原生質體誘變是通過去除菌體細胞壁以便更好地進行誘變的一種誘變方法，可使紫外線作用更為直接，可增強誘變效果。姚笛等對1株產木糖醇季也蒙的畢赤酵母進行原生質體紫外誘變，獲得的木糖醇產量明顯提高，比出發菌株DQ11提高了186%，且具有良好的遺傳穩定性[19]。胡基華等對1株產幾丁質酶的黏質沙雷氏菌進行原生質體紫外誘變，獲得比原始菌株提高4.3倍的幾丁質酶產量[20]。本研究通過原生質體誘變試驗表明，NaCl為最佳的分枝桿菌原生質體滲透穩定劑，其最適濃度為0.5 mol/L。在此條件下制備的原生質體通過紫外誘變，在搖瓶生物轉化中，獲得的高產穩定菌株MS23比出發菌株轉化制備9-OH-AD的能力提高了847%。通過初步的發酵罐放大轉化，9-OH-AD積累量達到50.41 mg/L。張懷成等研究的分枝桿菌轉化甾醇產 9α-羥基雄甾烯酮促進劑的篩選中，通過加入促進劑聚醚改性硅油投入10 g/L底物，獲得的9-OH-AD大于 4 g/L[11]。高興強等研究的油水乳化體系中分枝桿菌轉化植物甾醇產 9α-羥基雄甾烯酮中，投入20 g/L底物獲得1.28 g/L 9-OH-AD[12]。因此，雖然相對于出發菌株來說MS23菌株轉化植物甾醇制備9-OH-AD的能力有所提高，但 9-OH-AD 的積累量還是相對較低，還不能滿足工業化生產的要求。進一步的研究將對轉化過程的工藝進行系統優化，以期獲得更高的9-OH-AD制備率。

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