稻粒黑粉病、稻曲病、惡苗病病原真菌的MALDI—TOF—MS鑒定規范化條件研究

周莉質+宗凱+李云飛+姚劍+檀根甲

摘要：采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，簡稱MALDI-TOF-MS）技術對水稻作物的3種主要病原真菌進行分析，以獲得穩定的指紋圖譜。從菌物預處理方法、基質、點樣方法等3個方面進行比較，對影響MALDI-TOF-MS分析結果的主要因素進行優化。結果表明，菌物預處理方法對檢測結果的影響最大，熱處理法在細胞壁較厚的真菌樣品處理中可以獲得較完整的生物信息；構建稻粒黑粉病病菌（Tilletia horrida）、稻曲病病菌（Ustilaginoidea virens）、惡苗病病菌（Fusarium moniliforme）的MALDI-TOF-MS鑒定規范化方法，擴充MALDI-TOF-MS指紋圖譜數據庫，可簡便、快速、準確地對細胞壁加厚的真菌樣品進行鑒定。

關鍵詞：MALDI-TOF-MS；稻粒黑粉病；稻曲病；惡苗病；鑒定；指紋圖譜

中圖分類號： S435.111.4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）23-0093-07

水稻真菌病害大多是由病原菌的分生孢子、厚垣孢子以種子、土壤帶菌或空氣水流傳播的方式流行[1]。近年來由于新型超級稻的推廣，稻粒黑粉病、稻曲病、惡苗病的真菌病害逐漸上升為水稻的主要病害。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，簡稱MALDI-TOF-MS）技術可借助基質對非揮發性和熱不穩定性等生物大分子進行解吸電離，脈沖激發后離子云電離粒子真空向上通過飛行管探測器，產生1個頻譜圖被認為是該微生物的指紋圖譜[2]。

植物病原真菌各生長階段營養體差異較大，表達的蛋白種類和表達量有一定變化，與細菌相比，真菌孢子細胞壁含多糖和固醇類物質，在MALDI-TOF-MS鑒定中沒有單一的方法被作為常規處理方法使用，其結果常出現因培養條件不同而導致鑒定結果不準確的情況[3-5]。基于DNA序列的鑒定方法受PCR引物探針特異性、測序成本和時間等因素的制約。本研究對稻粒黑粉病病菌（Tilletia horrida）、稻曲病病毒（Ustilaginoidea virens）和惡苗病病菌（Fusarium moniliforme）的MALDI-TOF-MS鑒定從預處理方法、適用基質、點樣方法等3個方面進行優化[1，6]，對病原真菌建立標準規范化的 MALDI-TOF-MS鑒定方法并進行穩定性重復分析，為植物病原真菌的MALDI-TOF-MS鑒定方法提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗所用菌種分離自水稻帶菌種子中，由安徽出入境檢驗檢疫局植物檢疫實驗室保存。

PDA培養基：200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、18 g瓊脂，加入1 000 mL蒸餾水中加熱攪拌溶解，滅菌后待冷卻至55～60 ℃倒平板。

察氏培養基：3.00 g硝酸鈉、1.00 g磷酸氫二鉀、0.50 g硫酸鎂、0.50 g氯化鉀、0.01 g硫酸亞鐵、30.00 g蔗糖、18.00 g 瓊脂，加入 1 000 mL 蒸餾水中加熱攪拌溶解，滅菌后待冷卻至55～60 ℃ 倒平板。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜分析系統，購自日本島津公司。

1.2試驗方法

1.2.1MALDI-TOF-MS參數線性操作模式，延遲提取，分析離子帶正電荷，基質抑制偏轉模式，加速電壓為20 kV，提取電壓為18.6 kV，脈沖離子提取時間為3 500 ns，質荷比范圍為1 500～20 000，激光點擊數為每張圖譜80～100次，激光頻率60.0 Hz。使用大腸桿菌ATCC 8739作為外標校準物質。

1.2.2病原真菌的培養稻曲病病菌的培養：將純化保存的菌株接種于PDA平板中，28 ℃活化培養7 d。

惡苗病病菌的培養：將純化保存的菌株接種于察氏培養基平板中，28 ℃活化培養7 d。

稻粒黑粉病病菌厚垣孢子的獲得：病粒在75%乙醇中浸泡5 min后夾出，在濾紙上晾干，再用無菌水漂洗病粒2次，夾出病粒用濾紙吸干水分，用刀切開病粒將厚垣孢子抖入裝有無菌水的培養皿中，用擦鏡紙過濾得到稻粒黑粉病菌的厚垣孢子。

1.2.3樣品的預處理方法選擇用接種針各挑取20 mg（濕質量）稻曲病病菌、惡苗病病菌菌體和稻粒黑粉病病菌厚垣孢子，采用75%乙醇法、熱處理法、液氮研磨法、載玻片擠壓法、氧化鋯珠勻漿法等5種方法分別對3種真菌進行破壁預處理。

75%乙醇法：向20 mg菌體（厚垣孢子）中加入300 μL無菌水搖勻，再加入900 μL預冷的無水乙醇渦旋混勻，超聲處理 3 min 后12 000 r/min離心2 min，棄去上清液，沉淀物于室溫晾5 min[6]。

熱處理法：向20 mg菌體（厚垣孢子）中加入300 μL無菌水搖勻，沸水水浴加熱30 min，取出冷卻后加入1 mL無水乙醇，搖勻靜置3 min后12 000 r/min離心2 min。棄去上清液，沉淀物于室溫晾5 min。

液氮研磨法：將菌體（厚垣孢子）用液氮研磨后，加入 300 μL 無菌水并移入1.5 mL離心管內，加入900 μL預冷的無水乙醇渦旋混勻，靜置3 min后12 000 r/min離心2 min，棄去上清液，沉淀物于室溫晾5 min。

載玻片擠壓法：將菌體（厚垣孢子）用2片載玻片用力擠壓，在顯微鏡下觀察到孢子破裂即可。用300 μL無菌水將擠壓的菌體洗入1.5 mL離心管中，加入900 μL預冷的無水乙醇渦旋混勻，靜置3 min后12 000 r/min離心2 min，棄去上清液，沉淀物于室溫晾5 min。endprint

氧化鋯珠勻漿法：向20 mg菌體（厚垣孢子）中加入 300 μL 無菌水搖勻，加入100 mg氧化鋯珠（直徑0.5 mm），研磨棒勻漿5 min，加入900 μL預冷的無水乙醇渦旋混勻，靜置3 min后12 000 r/min離心2 min，棄去上清液，沉淀物于室溫晾5 min[7]。

向5種方法提取的沉淀物中加入30 μL 70%甲酸，將沉淀打散混勻，再加入30 μL乙腈，8 000 r/min離心1 min，取上清液進行MALDI-TOF-MS分析。

1.2.4基質的選擇采用“1.2.3”節中選出的最佳樣品預處理方法分別對病原真菌進行預處理，基質溶劑為水、乙醇、乙腈（體積比為1 ∶1 ∶1）的混合溶液，分別以α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）、2，5-二羥基苯甲酸（DHB）、芥子酸（SA）為基質進行MALDI-TOF-MS分析。

1.2.5點樣方法的選擇采用“1.2.3”節中最佳的樣品預處理方法對病原真菌進行預處理，選用“1.2.4”節中最佳的基質。試樣的點樣方法直接影響基質對生物信息物質的離子化程度，對有效基質的溶劑和點樣包被方法進行篩選可有效提高MALDI-TOF-MS檢測結果的有效性[6]。點樣方法有以下3種。

覆蓋干燥法：將1 μL真菌提取物點加到飛行質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization，簡稱MALDI）靶板上，室溫條件下晾干，再點加1 μL基質溶液覆蓋于樣品點上，室溫條件下晾干用于MALDI-TOF-MS分析。

夾心點樣法：將1 μL基質溶液點加在MALDI靶板上，室溫晾干形成種子層，然后在種子層上覆蓋1 μL樣品，室溫晾干，再點加1 μL基質溶液覆蓋于樣品點上，室溫條件下晾干用于MALDI-TOF-MS分析。

混合干燥法：將樣品上清液與基質溶液等體積混合，取 1 μL 混合液點加在MALDI靶板上，室溫條件下晾干用于MALDI-TOF-MS分析。

1.2.6重復性試驗為確定稻粒黑粉病、稻曲病、惡苗病病原真菌的MALDI-TOF-MS鑒定條件的穩定性，對這3種病原真菌的鑒定進行重復性試驗。采用“1.2.3”節中最佳樣品預處理方法對病原真菌進行預處理，選用“1.2.4”節中最佳基質和“1.2.5”節中最適的點樣方法進行重復性試驗。同一樣品的重復性試驗：每個樣品重復點樣10次，進行MALDI-TOF-MS分析。批間樣品的重復性試驗：對病原真菌進行3次重復培養、預處理提取、點樣等工作。

2結果與分析

2.1樣品預處理方法的確定

稻粒黑粉病、稻曲病、惡苗病病原真菌的預處理提取物以CHCA為基質的MALDI-TOF-MS分析結果分別如圖1、圖2、圖3所示。75%乙醇法對真菌類細胞壁過厚的樣品不適用，稻粒黑粉病病菌和惡苗病病菌未得到特征峰譜圖或強度過低，稻曲病病菌在質荷比小于4 000的小分子肽段部分背景噪音過高；液氮研磨法和氧化鋯珠勻漿法對真菌細胞破碎程度過高，使蛋白特征峰過低；載玻片擠壓法造成細胞破碎不完全，特征蛋白沒有完全釋放；熱處理法操作簡便，所得蛋白提取物的離子峰背景噪音最低，特征峰數量最多，離子激發強度適中且峰譜明顯。因此，選用熱處理法作為樣品預處理的最適方法。

2.2最適基質的確定

基質CHCA多用于多肽及小分子樣品的分析，DHB多用于糖類及小分子樣品的分析，SA多用于大于10 000 u的蛋白及大分子樣品的分析。由圖4至圖6可知，3種植物病原真菌胞內提取物中DHB包被的糖類小分子成分無法激發出特征成分；SA背景噪音較高，并無特征峰譜。基質篩選試驗表明，稻粒黑粉病病菌、稻曲病病菌、惡苗病病菌的細胞懸液提取物中特征成分主要為在質荷比小于10 000位置出現的多肽和小分子，以CHCA為基質獲得的圖譜較穩定，為最佳基質。

2.3點樣方法的確定

由圖7至圖9可知，稻粒黑粉病病菌混合干燥法只得到質荷比 3 847、 6 829、 7 497等3個特征峰且2次平行點樣重

復性較差，夾心點樣法在質荷比2 615、3 814位置出現非特異性峰且背景噪音較高；稻曲病病菌混合干燥法在質荷比4 000之前背景噪音過高無法辨識特征峰，夾心點樣法只能激發到質荷比4 414、8 823 等2個最強的峰值，其他強度不高的小峰不明顯；惡苗病病菌混合干燥法出峰凌亂無規律，夾心點樣法幾乎未檢測到特征物質且背景噪音較高。點樣方法試驗結果表明，覆蓋干燥法中基質對特征蛋白的離子化程度較高，特征蛋白峰譜較清晰，并能有效降低MALDI-TOF-MS背景的干擾。

2.4標準試驗方法重復性試驗

由圖10至圖12可知，同一樣品重復10次所得的特征峰譜一致，說明本試驗所選的樣品預處理方法、基質、點樣方法穩定可行。3種病原真菌分別進行3次重復培養和預處理提取、點樣等工作的MALDI-TOF-MS分析結果分別如圖 13至圖15所示，該方法從病原真菌的純培養條件到 MALDI-TOF-MS鑒定的各個步驟所得的特征蛋白的指紋圖譜一致、特征峰譜一致，說明病原真菌的鑒定結果可靠，重復性較好，特征峰譜數量多且豐度高。采用MALDI-TOF-MS自帶專業分析軟件 Biotyper 分別對稻粒黑粉病、 稻曲病、

惡苗病病原真菌圖譜進行分析，得到病原真菌標準指紋圖譜的特征峰信息如表1所示，在MALDI-TOF-MS鑒定方法相同并選用同種電離基質時，3種病原真菌在質荷比對應的位置應有的特征峰均出現。

3結論與討論

在沒有提取、分離和擴增的情況下，蛋白質作為最具特征性的物質可用于微生物的鑒定，而植物病原真菌的MALDI-TOF-MS鑒定準確性主要影響因素為預處理方法的差異[8-9]。預處理使用的75%乙醇法常用于破裂細菌細胞膜[10]，但該方法對真菌的厚垣孢子類細胞壁加厚的樣品并不能達到破裂效果。Adams等將病原菌經過75%乙醇破裂后再進行勻漿和超聲處理[3]，該方法在本試驗中并未得到相似的結果，超聲處理后細胞內蛋白小分子結構松散，不利于與基質結合。MALDI-TOF-MS技術在植物病原菌的鑒定和研究應用中要依靠病原菌指紋圖譜數據庫，建立足夠種類的已知病原菌指紋圖譜庫才能實現最有效、最真實的鑒定結果[8]，且應對病原菌進行歸類，建立不同的預處理方法和標準基質以得到最穩定的結果，提高指紋圖譜數據庫比對的準確性。endprint

本試驗對3種水稻病原真菌進行細胞內含物粗提取，沸水水浴30 min細胞壁破裂較完全，所得細胞內含物主要為胞內小分子粗蛋白，蛋白與基質CHCA所得MALDI-TOF-MS圖譜背景較低，特征峰數量多且豐度高，經過多次重復試驗，培養條件相同的情況下所得的蛋白指紋圖譜重復性良好，該方法可用于細胞壁加厚類真菌樣品的蛋白提取和MALDI-TOF-MS分析。

參考文獻：

[1]Anne-Cécile N，Carole C，Stéphane R，et al. Assessment of various parameters to improve MALDI-TOF MS reference spectra libraries constructed for the routine identification of filamentous fungi[J]. BMC Microbiology，2013，13（1）：76.

[2]Croxatto A，Prodhom G，Greub G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology[J]. FEMS Microbiology Reviews，2012，36（2）：380-407.

[3]Adams L L，Salee P，Dionne K，et al. A novel protein extraction method for identification of mycobacteria using MALDI-TOF MS[J]. Journal of Microbiological Methods，2015，119：1-3.

[4]Horká M，Kubesová A，Salplachta J，et al. Capillary and gel electromigration techniques and MALDI-TOF MS—suitable tools for identification of filamentous fungi[J]. Analytica Chimica Acta，2012，716（4）：155-162.

[5]Chalupová J，Raus M，Sedlárˇová M，et al. Identification of fungal microorganisms by MALDI-TOF mass spectrometry[J]. Biotechnology Advances，2014，32（1）：230-241.

[6]李鳳琴，吳多加，武淑真，等. 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜檢測與鑒定食品真菌的研究[J]. 中國食品衛生雜志，2007，19（5）：385-393.

[7]Brun S，Madrid H，van den Ende B G，et al. Multilocus phylogeny and MALDI-TOF analysis of the plant pathogenic species Alternaria dauci and relatives[J]. Fungal Biology，2013，117（1）：32-40.

[8]馮建軍，龍海，劉新嬌，等. MALDI-TOF質譜技術鑒定植物病原體研究進展[J]. 植物檢疫，2014（6）：13-18.

[9]Bader O. MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical mycology[J]. Proteomics，2013，13（5）：788-799.

[10]Branquinho R，Sousa C，Lopes J，et al. Differentiation of Bacillus pumilus and Bacillus safensis using MALDI-TOF-MS[J]. PLoS One，2014，9（10）：e110127.江蘇農業科學2017年第45卷第23期劉曉娜， 杜以梅， 杜予州. 揚州地區煙粉虱生物型檢測及發生動態[J]. 江蘇農業科學，2017，45（23）：100-102.endprint