全基因組預測褐環乳牛肝菌的分泌蛋白

韓長志+劉艷+任雪敏

摘要：褐環乳牛肝菌作為針葉樹種上重要的外生真菌，為宿主植物提供營養元素和水分，在此過程中，對于該菌分泌蛋白發揮的作用機制尚不清楚。利用SignalP、ProtComp等預測程序對褐環乳牛肝菌中18 303條蛋白質序列進行分泌蛋白找尋，明確其含有327個分泌蛋白，同時，對上述分泌蛋白的氨基酸大小分布、信號肽長度、信號肽切割位點等進行分析，明確該菌分泌蛋白的氨基酸長度集中于51～450 aa，信號肽長度以17～21 aa的序列最為集中，其信號肽切割位點均屬于A-X-A類型。通過上述生物信息學分析方法有效地實現了褐環乳牛肝菌分泌蛋白的預測，分泌蛋白的信號肽切割位點類型與其他已經報道的致病疫霉、粗糙脈孢霉、禾谷炭疽菌等分泌蛋白信號肽切割位點一致。研究結果為進一步解析分泌蛋白在該菌為宿主植物提供營養過程中發揮的作用機制提供重要的理論支持。

關鍵詞：褐環乳牛肝菌；全基因組；分泌蛋白；信號肽；預測程序

中圖分類號： S182文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）23-0045-04

E-mail：hanchangzhi2010@163.com。褐環乳牛肝菌（Suillus luteus），別稱褐環黏蓋牛肝菌、黃黏團子、土色牛肝菌等。目前，對該菌的研究主要集中在發酵生物學[1]、發酵條件[2]、培養條件[3]方面，以及其對樟子松、油松苗的促生作用[4]和與木霉協同促進紅皮云杉苗木抗逆增效作用[5]等方面，此外還有過量鈉鹽、堿性pH值[6]和平菇汁[7]、接種量[8]對其生長影響及pH值對其三羧酸循環、草酸分泌及代謝途徑中關鍵酶活性影響[9-10]等方面。作為針葉樹種的重要外生菌根菌之一，褐環乳牛肝菌在提高根系對磷元素和水分的吸收方面發揮著重要作用[11]，然而，在此過程中，該菌中分泌蛋白所發揮的作用機制尚不清楚。

真菌中分泌蛋白一般具有N-端含有信號肽、無跨膜結構域、無糖基磷脂酰肌醇化蛋白（GPI）錨定位點以及沒有將蛋白輸送至線粒體或其他胞內細胞器的預測定位信號等4個基本特征。前人基于上述特征，對黃孢原毛平革菌[12]、結核分枝桿菌[13]、釀酒酵母[14]、根癌土壤桿菌[15]、禾谷鐮刀菌[16]、粗糙脈孢菌[17]、稻瘟菌[18]、大麗輪枝菌[19]、致病疫霉[20]、米曲霉[21]、禾谷炭疽菌[22]等分泌蛋白進行生物信息學預測。然而，對褐環乳牛肝菌分泌蛋白的研究尚未見報道，隨著S. luteus UH-Slu-Lm8-n1全基因組序列的釋放[23]，為開展該菌分泌蛋白的預測提供了數據支持。本研究以S. luteus蛋白數據庫中的18303條序列為基礎，利用SignalP、ProtComp等預測程序對分泌蛋白進行找尋，以期進一步解析分泌蛋白為宿主植物提供營養方面的功能研究打下堅實的理論基礎。

1材料與方法

1.1褐環乳牛肝菌數據來源

S. luteus的全基因組序列來源于NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term=Suillus）。

1.2分泌蛋白確定方法

參照前期對禾谷炭疽菌分泌蛋白的預測方法進行[22]。具體而言，利用SignalP v3.0[24]獲得N端具有信號肽的蛋白序列，并利用ProtComp v9.0[25]實現上述蛋白的定位；再通過TMHMM v2.0[26]對蛋白的跨膜結構域進行預測，并利用 big-PI Fungal predictor在線分析實現蛋白脂質錨定修飾（glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins，簡稱GPI）的預測[27]；最后，利用TargetP v1.1[28]實現非胞外分泌蛋白的排除，最終明確S. luteus中的分泌蛋白。

1.3分泌蛋白信號肽酶識別位點預測

利用LipoP v 1.0[29]預測S. luteus中分泌蛋白的信號肽酶識別位點。

2結果與分析

2.1褐環乳牛肝菌中分泌蛋白的預測

S. luteus中含有18 303個蛋白質序列，其中，氨基酸長度最小的蛋白為49 aa，最大的為5 054 aa，蛋白多分布在800 aa以下，有16 966個，比例高達92.70%，尤以分布在51～100 aa 的蛋白數量最多，為4 088個，比例為22.34%。而高于1 000 aa的蛋白，數量較小，比例為1.93%（圖1）。

首先，對上述18 303個蛋白序列進行信號肽預測，發現 1 083 個蛋白具有信號肽序列；其次，對上述蛋白進行亞細胞定位預測，發現有378個蛋白分泌至胞外，705個蛋白質并不分泌到胞外，其中299個蛋白轉運至細胞質膜，151個蛋白傳輸至線粒體，104個蛋白轉運至內質網，58個蛋白轉運至高爾基體，30個蛋白轉運至液泡中，25個蛋白轉運至溶酶體中，而轉運至細胞質、細胞核以及過氧化物酶的蛋白質總共有38

個；再次，對上述序列進行跨膜結構域分析，發現有290個蛋白不含有跨膜結構域，有88個蛋白含有不同數量的跨膜結構域，其中，含有1個跨膜結構域的蛋白數量為77個，含有2個跨膜結構域的蛋白數量為8個，含有3個跨膜結構域的蛋白數量為3個。結合前期分析結果，將290個不含跨膜結構域的推測蛋白和77個含有1個跨膜域的蛋白，合計367個蛋白均初步推斷為分泌蛋白，繼而進行后續GPI錨定蛋白的預測；接下來對上述序列進行GPI錨定蛋白預測，發現23個蛋白是GPI錨定蛋白，334個蛋白序列不具有GPI錨定位點，還有10個序列小于55個氨基酸殘基未能進行分析；最后，利用TargetP對344個非GPI錨定的蛋白進行分析，發現327個蛋白含有胞外定位信號，14個蛋白含有線粒體目標肽，3個蛋白含有其他定位信號。通過上述分析，最終獲得327個具有4個典型特征的分泌蛋白。endprint

2.2褐環乳牛肝菌分泌蛋白氨基酸長度及信號肽特征

通過對327個分泌蛋白進行氨基酸大小分析，發現這些分泌蛋白在51～100 aa的數量最多，比例最大，為26.30%，其次為101～150 aa的分泌蛋白，比例為16.51%（圖2）。通過對不同長度的氨基酸進行分析發現，尤以450 aa以下的分泌蛋白所占比例較高，為80.12%。結果表明，分泌蛋白多屬于小型蛋白，其所含氨基酸長度一般較小，這與前期研究得出的禾谷炭疽菌[22]、樟疫霉[30]等病原菌分泌蛋白特征相一致。

對上述分泌蛋白所含信號肽進行氨基酸長度分析，發現含有信號肽長度為17～21 aa的蛋白質數量最多，比例為6391%，其中尤以所含信號肽長度為19 aa的蛋白序列居多，比例為16.82%（圖3）。另外，利用LipoP對上述分泌蛋白進行信號肽酶識別位點的預測分析，發現244個蛋白序列含有SPⅠ型信號肽識別位點，5個含有SPⅡ型信號肽識別位點，比例分別為74.62%、1.53%，說明S. luteus中的分泌蛋白大部分是由SPⅠ型信號肽酶進行識別，從而切除信號肽的。

此外，通過對S. luteus分泌蛋白信號肽的切割位點 -3～+3 位進行統計分析，發現位于-3位、-2位、-1位、1位、2位、3位最多的氨基酸分別為A（丙氨酸）、S（絲氨酸）、A、A、P（脯氨酸）、V（纈氨酸）/T（蘇氨酸）（表1）。因此，位于信號肽切割位點之前的氨基酸組成為ASA，屬于AXA類型，為SPⅠ型信號肽識別位點，與通過LipoP預測的結果相一致，同時，也與前人通過對粗糙脈孢菌[17]、馬鈴薯晚疫病菌[20]、禾谷炭疽菌[22]等分泌蛋白具有的信號肽的酶切位點類型報道一致。上述結果表明，無論是植物病原菌，還是植物共生菌，對于分泌蛋白進行信號肽序列識別、切割的信號肽酶類型多為Ⅰ型。

3討論與結論

隨著S. luteus全基因組序列的公布，為深入解析其基因功能的研究提供了重要的數據基礎。云南松（Pinus yunnanensis）是我國西南地區尤其是云南省境內重要的建群樹種，也是該地區的荒山綠化造林先鋒樹種，其面積、蓄積量分別占云南省林地面積、蓄積量的29.2%、15.8%[31-34]。作為該樹種上重要的外生菌根菌，S. luteus在營養元素利用和水分吸收方面發揮著重要作用。據報道，宿主植物中約20%的凈初級生產力將傳遞給外生菌根[35]，其生物量在溫帶森林中約占土壤微生物總生物量的30%[36]。

植物與病原菌互作過程中，病原菌為了實現在植物中定殖、擴展等過程，利用分泌蛋白實現其致病、生長等生理過程。然而，對于外生菌根菌分泌蛋白在營養元素利用和水分吸收方面所具有的功能，尚不明確。本研究發現S. luteus中存在327個具有典型特征的分泌蛋白，與前期獲得的禾谷炭疽菌[22]、樟疫霉[30]的分泌蛋白數量相比，明顯較少，是否是由于該菌不是致病菌，致使其所具有的參與植物體內定殖、擴展相關的分泌蛋白退化所造成的，有待于今后進一步得以明確。就S. luteus分泌蛋白所具有的氨基酸長度而言，多集中于 51～450 aa之間，比例為80.12%；就分泌蛋白所具有的信號肽長度而言，多集中于15～28 aa之間，比例高達94.19%，上述特征與致病菌分泌蛋白所具有的特征相似。

本研究基于S. luteus蛋白質數據庫中的18 303條序列，利用SignalP、ProtComp、TMHMM、big-PI Fungal Predictor和TargetP等預測程序總共獲得327個分泌蛋白，明確該數量明顯低于致病菌的分泌蛋白數量，同時，通過對上述分泌蛋白進行氨基酸長度、信號肽長度以及信號肽酶切位點等方面的研究，發現上述分泌蛋白屬于小型蛋白，其信號肽長度多集中于17～21 aa，同時發現真菌信號肽的酶切位點類型具有保守性特點。本研究為深入開展S. luteus中的分泌蛋白功能研究打下了一定的理論基礎。

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