心腦舒通膠囊對血管性癡呆大鼠的神經保護作用*

Batnairamdal Chuluun，王金鑫，李芮琳，盧國彥，郭 虹，柴麗娟，張 玥，王少峽，胡利民

血管性癡呆（VD）是與腦血管疾病有關的老年期癡呆的一種主要類型，多與神經損傷、腦血管疾病的危險因素（高血壓、糖尿病等）有關，臨床表現為認知功能障礙，記憶力下降等[1]。隨著中國老齡化社會的到來，近年VD的發病率明顯上升，所以尋找有效預防和治療VD的藥物迫在眉睫。心腦舒通膠囊的有效成分為蒺藜科植物的干燥全草提取物,其主要成分為以呋甾醇與螺甾醇為主要成分的蒺藜總皂苷，具有活血化瘀，舒利血脈的作用[2-3]。臨床多應用于防治胸痹心痛、中風恢復期的半身不遂、語言障礙和動脈硬化等心腦血管缺血性疾病，并取得確切的療效[4-5]。本研究采用雙側頸總動脈永久性結扎的方法制作VD大鼠模型，通過考察癡呆大鼠學習記憶能力、大腦海馬區神經細胞的狀態、星形膠質細胞及小膠質細胞的表達來探究心腦舒通膠囊對VD大鼠的神經保護作用及可能機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康雄性SPF級Wistar大鼠80只，體質量（300±20）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（北京）2012-0001，動物飼養于天津市實驗動物中心，分籠飼養，自由飲食、飲水，飼養溫度為22～25℃，相對濕度40%～60%，每周更換墊料2次。

1.2 藥品及試劑 心腦舒通樣品（其中呋甾皂苷含量約占43.18%，由吉林敖東洮南藥業股份有限公司提供），臨用前用生理鹽水溶解。星形膠質細胞特異性蛋白GFAP的抗體（Sc-6171）、Donkey anti-goat Ig G（Sc-2042）購自 Santacruz；小膠質細胞特異性蛋白Iba-1的抗體（Ab5076）購自Abcam。尼氏染色試劑盒、防脫載玻片、中性樹膠封片液購自碧云天公司。磷酸鹽緩沖液（PBS）；多聚甲醛；二甲苯；無水乙醇；95%乙醇等化學試劑均為市售分析純。

1.3 實驗儀器 水迷宮系統（北京碩林源科技有限公司，Topscan lite）；全自動封閉脫水機（LEICA，ASP300S）；病理撈片機（LEICA，HI1210）；烤片機（LEICA，HI1220）；生物組織包埋機（BMJ-1，天津航空機電公司）；切片機（LEICA，RM2135）；光學顯微鏡（OLYMPUS，CHA30）；顯微數碼拍攝圖像分析系統（Nikon，NIS-Elemenis）等。

2 實驗方法

2.1 動物模型復制方法 參照文獻[6]，本實驗采用雙側頸總動脈永久性結扎的方法復制VD大鼠模型，術前12h禁食不禁水，異氟烷氣體麻醉。將Wistar大鼠仰臥固定四肢，頸部正中切口，分離左側頸總動脈，用4號線結扎，縫合皮膚，一周后重新麻醉，分離右側頸總動脈并用4號線進行結扎，縫合皮膚。對照組只分離頸總動脈，穿線但不結扎。

2.2 實驗分組及給藥 將造模成功的54只大鼠按照隨機數字表法隨機分為3組：心腦舒通56 mg/kg組（XNST-56）、心腦舒通 14 mg/kg組（XNST-14）、模型組各18只，對照組10只。心腦舒通組成模后給予心腦舒通混懸液（10 mL/kg體質量）灌胃；模型組和對照組給予等量的生理鹽水灌胃，每天灌胃給藥1次，持續給藥60 d。

2.3 檢測方法

2.3.1 Morris水迷宮檢測 水迷宮實驗是利用水迷宮系統和小動物運動行為分析系統研究大鼠的海馬等腦區受到損害后的學習、記憶和空間定向以及認知能力的實驗。分為環境熟悉、定位巡航和空間探索3個階段。第1階段主要使大鼠熟悉實驗環境及實驗人員；定位航行階段，主要記錄大鼠的逃避潛伏期的變化；空間探索階段，主要記錄大鼠穿過平臺的次數和游泳速度。

2.3.2 海馬CA1區的尼氏染色 大鼠光鏡下觀察海馬CA1區神經細胞形態學改變，在40×10倍的光鏡下隨機選擇5個視野，統計神經元的個數，以對照組作為100%，統計其他各組的百分比。

2.3.3 SABC法染色GFAP和Iba-1 星形膠質細胞（GFAP）和小膠質細胞（Iba-1）染色標本為心臟灌流固定后的腦組織，進行切片。應用SABC免疫組化法和DAB顯色法分別對組織中GFAP和Iba-1進行染色，光鏡下觀察星形膠質細胞的形態及數量變化情況。

2.4 統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行統計學處理。所有數據均采用均數±標準差（x±s）表示，數據處理采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 心腦舒通膠囊對VD大鼠體質量的影響 造模成功后，給藥過程中，每周稱量一次大鼠體質量統計。見圖1。從圖1中可以看出，與對照組比較，手術組在初始前3周時，體質量顯著下降（P＜0.01），給予心腦舒通膠囊治療3周后，治療組體質量增加，恢復到接近對照組的水平。

3.2 心腦舒通膠囊對VD大鼠學習和記憶的改善作用 水迷宮實驗結果表明，心腦舒通膠囊對VD大鼠學習和記憶的改善作用，如圖2所示。與對照組比較，模型組的逃避潛伏期明顯增加（P＜0.01），與模型組比較，心腦舒通14 mg/kg及56 mg/kg組逃避潛伏期明顯降低（P＜0.01）。空間探索實驗表明，與對照組相比較，模型組通過平臺的次數明顯減少（P＜0.01），各治療組通過平臺次數有所增加，但無統計學差異。通過對各組大鼠空間探索階段游泳速度的統計，各組大鼠體力沒有統計學差異（P＞0.05）。

圖1 心腦舒通膠囊對VD大鼠體質量的影響Fig.1 Effectsof XNST on VD ratsof body weight

圖2 心腦舒通膠囊對VD大鼠學習和記憶的改善作用Fig.2 Effectsof XNST on VD ratsoflearning and memory ability

3.3 心腦舒通膠囊對VD大鼠腦組織病理損害的影響 尼氏染色結果表明，對照組腦組織切片中可見海馬CA1區神經元細胞染色較深，尼氏體顆粒較大且多見，細胞排列整齊，核仁清晰可見，見圖3。模型組腦組織切片中可見海馬CA1區神經細胞排列紊亂、稀疏，染色淺，尼氏體顆粒小，數量少。心腦舒通56 mg/kg組腦組織切片中可見海馬CA1區尼氏體染色較深，顆粒大且多見，細胞排列整齊，接近正常。對其神經細胞的數目進行統計可以看出，模型組比對照組神經細胞數目明顯降低（P＜0.01），給藥后心腦舒通56 mg/kg組較模型組神經細胞顯著性增加（P＜0.01），心腦舒通14 mg/kg組也有增加趨勢，但無統計學差異（P＞0.05）。

3.4 心腦舒通對VD呆大鼠GFAP和Iba-1表達的影響 采用SABC免疫組化法來探究心腦舒通膠囊對星形膠質細胞GFAP和小膠質細胞Iba-1表達的影響，結果表明，模型組大鼠海馬CA1區GFAP和Iba-1表達明顯增多，細胞深染，突起變長、增粗和分支增多，見圖4。而心腦舒通給藥組GFAP和Iba-1表達減少，細胞染色較淺，突起細短，從而證明心腦舒通膠囊能抑制缺血損傷后星形膠質細胞和小膠質細胞的過度活化，抑制GFAP和Iba-1的表達。

4 討論

VD是指各種腦血管病引起腦功能障礙而產生的獲得性智能損害綜合征，是僅次于阿茨海默氏病的第2位的最常見癡呆[7]。然而由于生存環境、生活方式、體質差異等原因，也有報道稱在亞洲及許多發展中國家，VD視為老年性癡呆的首發原因[8-9]。VD的主要臨床癥狀為記憶力減退和認知功能障礙，這與大腦海馬區的功能相關。海馬區神經細胞的損傷死亡是導致VD的主要原因，所以神經細胞損傷后的修復對VD的治療具有重大的意義。小膠質細胞是中樞神經系統的巨噬細胞，具有免疫防御和炎癥反應[10]，在生理條件下，休眠的小膠質細胞有平衡神經系統和支持神經細胞的重要作用。抑制小膠質細胞過度活化所引起的炎癥反應可以作為治療和緩解神經退行性疾病和腦損傷的重要途徑之一[11-12]。星形膠質細胞具有支持、營養神經細胞的作用，但在腦缺血的病理狀態下，星形膠質細胞被激活后產生大量的一氧化氮、白細胞介素-6等細胞毒性因子，而引起神經元的損傷[13-14]。所以在腦損傷后抑制小膠質細胞和星形膠質細胞的過度表達，對腦損傷后的恢復具有重要意義。心腦舒通膠囊的主要成分為蒺藜總皂苷，具有舒利血脈、平肝解郁、活血祛風的藥理作用，現代研究發現蒺藜皂苷具有降血脂、改善腦循環，保護缺血腦組織的作用等[15-16]，臨床多用于腦中風后的恢復等心腦血管疾病。

圖3 心腦舒通膠囊對VD大鼠腦組織病理損害的影響Fig.3 Effects of XNST on VD rats of neuronal cell count in hippocampus

圖4 心腦舒通對VD大鼠GFAP和Iba-1表達的影響Fig.4 Effectsof XNST on VD ratsof the expression GFAP and IBA-1 of the hippocampus

本研究表明，心腦舒通膠囊能顯著提高VD大鼠的學習和記憶能力，心腦疏通能明顯降低大鼠的水迷宮逃避潛伏期，明顯增加在定位巡航階段穿過平臺的次數。海馬CA1區尼氏染色表明，心腦舒通膠囊能改善神經細胞的形態和活力,促進神經細胞再生。此外，心腦舒通能降低星形膠質細胞和小膠質細胞的過度活化，抑制GFAP和Iba-1表達。這些結果為心腦舒通膠囊對VD大鼠的神經保護作用及部分機制提供理論依據。

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