非索非那定體內探針藥物法考察腦心通膠囊對大鼠P-gp活性的影響*

歐陽慧子，劉華明，王興蕊，常艷旭，何 俊

腦心通膠囊由黃芪、赤芍、丹參、當歸、川芎等16味中藥組成，具有益氣活血、化瘀通絡等作用，臨床上常與西藥聯合使用用于中風、腦梗死、冠心病和心絞痛等疾病的治療[1-2]，并取得了較好的療效。腦心通膠囊所含化學成分眾多[3]，與其他藥物聯合使用時易產生藥物間的相互作用。P糖蛋白（P-gp）為細胞膜上的磷糖蛋白，廣泛存在于人體的各組織器官中。作為體內組織的一種外排轉運蛋白，P-gp對藥物的吸收、分布、代謝以及排泄過程均會產生較大的影響，是許多藥物之間產生相互作用的重要影響因素[2]。

目前，在對藥物影響P-gp活性的評價研究中，探針底物法是一種廣泛使用的方法。相關研究已證實，非索非那定的吸收與腸黏膜上P-gp密切相關[3]，P-gp介導的腸道分泌可以降低其口服吸收，選擇非索非那定作為P-gp的體內探針藥物，檢測其在體內的藥物濃度，可有效的反應藥物對體內P-gp活性的影響[6-8]。腦心通膠囊所含化學成分眾多，其所含化學成分如丹參酮ⅡA、川芎嗪等可對P-gp活性產生影響[9-11]，聯合用藥時可能會通過影響P-gp的活性而引發藥物間的相互作用。因此，本研究采用非索非那定探針藥物法考察腦心通膠囊對P-gp活性的影響，為腦心通膠囊臨床聯合安全用藥提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 6430型三重四級桿質譜儀，配備電噴霧離子源（美國Agilent公司）；Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Agilent MassHunter分析軟件（美國Agilent公司）；AX 205型十萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q超純水制備儀（Millipore公司）；3 K 15型高速離心機（美國Sigma公司）；XW-80 A型旋渦混合器（上海滬西分析儀器廠）。

1.2 試劑與藥物 非索非那定（購自中國食品藥品檢定研究院，批號為100852-201202，含量為99.8%）；苯海拉明（購自中國食品藥品檢定研究院，批號為100066-200807，含量為99.9%）；腦心通膠囊（購自陜西步長制藥有限公司）；乙腈、甲醇均為色譜純，購自Merk公司；甲酸為色譜純，購自ROE公司；超純水為Milli-Q制備。

1.3 動物 健康雄性Sprague-Dawley大鼠，SPF級，體質量（230±10）g，購自天津市山川紅實驗動物科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters XBridgeTMC18柱（2.1 mm×100 mm,3.5μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫，洗脫程序為 0～3 min，25%～90%A；3～6 min，90%～25%A；流速 0.4 mL/min；柱溫30℃；進樣量5μL。

2.2 質譜條件 電噴霧離子源，多反應正離子模式監測；毛細管溫度為350℃；干燥氣流速9 L/min；霧化器壓力10 psi。非索非那定的定量離子對為m/z502.3→466.3，碎裂電壓120 V，碰撞能量25 V；內標苯海拉明的定量離子對為m/z 256.1→166.9，碎裂電壓70 V，碰撞能量5 V。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱定非索非那定對照品5 mg，用甲醇溶解，配制為1 mg/mL的非索非那定對照品儲備溶液。另取內標苯海拉明對照品1 mg，用甲醇稀釋為250 ng/mL的內標溶液，4℃冰箱儲存備用。

2.4 非索非那定及腦心通供試品溶液的制備 精密稱取非索非那定對照品適量，以20%的甘油溶液溶解，配制成濃度為1.256 mg/mL的非索非那定溶液，置4℃冰箱中儲存備用。精密稱取腦心通藥品粉末適量，采用0.5%CMC-Na溶液配制成濃度為50 mg/mL的腦心通供試品溶液，置4℃冰箱中儲存備用。

2.5 血漿樣品處理方法 精密量取血漿樣品100μL，依次加入25μL內標溶液（苯海拉明250 ng/mL），25μL空白甲醇，渦旋混勻，加入400μL乙腈，渦旋3 min，14 000 r/min離心 5 min，取上清 500μL氮氣吹干，100μL甲醇復溶，渦旋 3 min，14 000 r/min離心10 min，取上清進樣分析。

2.6 方法學考察

2.6.1 專屬性考察 精密量取100μL空白血漿，除不加內標外，其他按“2.5”項下處理并進樣測定，得MRM圖譜A；將一定量的非索非那定對照品溶液及內標溶液加入空白血中，同法處理，得MRM圖譜B；取大鼠灌胃后的血漿樣品依同法處理，得MRM圖譜C。非索非那定的保留時間為4.47 min，內標苯海拉明的保留時間為3.80 min，血漿樣品中內源性物質不干擾非索非那定和內標的測定，結果如圖1所示。

2.6.2 標準曲線及線性范圍 取大鼠空白血漿配制成含非索非那定濃度分別為 1、2、10、25、50、100、250 ng/mL的血漿樣品，按照“2.5”項下方法處理，取上清進樣分析并記錄，以非索非那定與內標的峰面積的比值Y為縱坐標，血漿樣品中非索非那定的濃度X為橫坐標，線性加權回歸，權重系數為1/x2，求得非索非那定的回歸方程為Y=0.505 082X+0.005 755，r=0.998 1，以 S/N=10為最低定量限，則非索非那定的最低定量限為1 ng/mL。

2.6.3 精密度與準確度 精密量取大鼠空白血漿及一定量的非索非那定對照品溶液，配制成含非索非那定濃度分別為2、25、250 ng/mL的低、中、高3個濃度的質控樣品（QC）各6份，按“2.5”項下方法處理，連續測定3 d，計算方法的日內、日間精密度。得非索非那定低、中、高3個濃度QC樣品日內、日間精密度RSD值分別小于8.7%和7.1%，準確度在93.9%～109.1%之間。

圖1 非索非那定(2)和內標(1)的MRM圖Fig.1 Representative MRM chromatogramsof IS(1)and fexofenadine(2)

2.6.4 回收率及基質效應 取非索非那定濃度為2、25、250 ng/mL的低、中、高3個濃度的QC樣品各6份，按“2.5”項下操作處理，取上清，進樣 5μL，記錄峰面積為A1；另取空白血漿100μL，除不加內標外，按“2.5”項下操作至乙腈萃取上清液氮氣吹干，所得空白基質殘渣分別用相應低、中、高濃度混合對照品溶液復溶，進樣測定，記錄峰面積為A2，則回收率為R=A1/A2×100%；同樣條件下，進樣相應濃度低、中、高濃度對照品溶液，記錄各化合物峰面積為A0；則基質效應M=A2/A0×100%。3個濃度QC樣品的回收率分別為（83.0±7.3）%，（86.8±3.7）%，（87.2±1.0）%；內標苯海拉明的回收率為（66.4±2.6）%。3個濃度QC樣品的基質效應分別為（86.2±4.2）%，（92.1±2.9）%，（90.0±1.0）%。內標苯海拉明的基質效應為（90.4±2.1）%。

2.6.5 穩定性實驗 制備低、中、高3個濃度（2、25、250 ng/mL）的 QC 品各 3份，按“2.5”項下操作，分別考察樣品在室溫下放置4 h、反復凍融3次再處理、處理后放置自動進樣器24 h以及血漿樣品放置-70℃冰箱7 d的穩定性。非索非那定準確度均在88.2%～108.1%之間，RSD值在1.4%～7.4%之間。結果表明樣品在上述條件下非索非那定穩定性良好。

2.7 藥代動力學研究 雄性SD大鼠18只，給藥前禁食24 h，自由飲水。非索非那定和腦心通膠囊分別采用20%的甘油和0.5%CMC-Na混懸溶液溶解，給藥劑量按照臨床給藥劑量折算，非索非那定的實際給藥劑量為12.56 mg/kg，腦心通膠囊的給藥劑量為500 mg/kg。實驗分3組，分別為非索非那定單次給藥組（A組），非索非那定和腦心通聯合單次給藥組（B組），腦心通給藥7 d，第8天灌胃給予非索非那定和腦心通組（C組），分別于給藥前及給藥后 0.03、0.08、0.17、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h經大鼠眼底靜脈叢取血，置于肝素化塑料管中，7 000 r/min離心10 min，-70℃冰箱儲存，直到進樣分析。

3種給藥方式下非索非那定平均血藥濃度時間曲線見圖2。采用DAS1.0軟件計算3組大鼠口服非索非那定的藥動學參數，結果見表1。實驗數據采用SPSSStatistics統計軟件處理，采用單因素方差分析比較各組間的藥動學參數差異，組間兩兩比較采用Dunnett檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果與討論

實驗采用苯海拉明作為內標，其保留時間較待測物非索非那定的保留時間較早，且不影響待測物的測定。有文獻報道，非索非那定血漿處理方法包括有機溶劑提取法和固相萃取法等。有機溶劑提取操作步驟較為繁瑣，固相萃取法成本較高[12]。本實驗采用乙腈沉淀蛋白的方法對血漿樣品進行預處理，非索非那定的提取回收率為83.0%～87.2%，內標為66.4%左右，滿足生物樣品測定條件。

表1 不同組大鼠口服非索非那定的藥動學參數Tab.1 Pharmacokinetic parameters of fexofenadine in different groups

圖2 給藥后非索非那定的平均血藥濃度時間曲線Fig.2 Mean plasma concentration-time curvesof fexofenadine in ratsafter oral administration

文章以非索非那定為探針底物，建立快速評價大鼠體內P-gp活性的LC-MS/MS檢測方法，并用于考察腦心通膠囊對大鼠體內P-gp活性的影響。結果表明，腦心通膠囊單次給藥對非索非那定藥動學的影響未呈現統計學意義，但經連續8 d灌胃給藥腦心通膠囊后，非索非那定的 AU C（0－tn）、AUC(0-∞)顯著性升高，提示大鼠經連續灌胃給藥腦心通膠囊后，可能對大鼠體內P-gp的活性產生了抑制作用，并導致P-gp對非索非那定的外排作用減弱。以上藥動學參數的差異可能與腦心通膠囊中丹參、川芎等藥材所含化學成分有關，長期灌胃給予腦心通膠囊后會影響大鼠體內P-gp活性的表達。

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