循環腫瘤細胞的檢測及其在肺癌診療中的應用

王曉楠,程民,胡世蓮

(安徽醫科大學附屬省立醫院、安徽省立醫院老年醫學科，安徽省老年醫學研究所，腫瘤免疫與營養治療安徽省重點實驗室，安徽省循證醫學中心,合肥 230001)

在惡性腫瘤中，肺癌的發病率和病死率居于首位[1]。據統計，肺癌初診患者中約40%存在遠處轉移，根治性手術治療后亦有30%～60%的患者發生遠處轉移[2]。目前肺癌的臨床診斷與治療技術已經達到了相當完備的水平，但肺癌的復發和轉移仍是阻礙患者生存期提高的主要原因。近些年，新的檢測手段和治療方法使肺癌患者的預后得到改善，但仍難以達到早期確診，早期治療。腫瘤的轉移和復發是一個多階段、多步驟的復雜過程，其中腫瘤細胞進入外周血是腫瘤發生遠處轉移和復發的重要一步。循環腫瘤細胞(CTCs)來自原發灶或轉移灶腫瘤脫落進入外周血液循環的腫瘤細胞[3]。臨床研究表明，CTCs參與腫瘤血行轉移過程，進入外周血后絕大部分CTCs在短期內死亡，只有極少部分CTCs可以在血液中存活，它們具有高度活性、高度轉移潛能、自我增殖能力，并且可以通過聚集形成微小癌栓，在適宜的條件下發展成微小轉移灶。因此，在血液中檢測到CTCs提示腫瘤形成或已經發生了擴散或遠處轉移[4]。

早在1896年，澳大利亞學者Ashworth在一個轉移性腫瘤患者的尸檢報告中首次提出了循環腫瘤細胞的概念，他發現腫瘤患者的血液中存在腫瘤細胞，并定義為循環腫瘤細胞。這些細胞存在于外周血、淋巴、骨髓中，在一定的條件下增殖、浸潤、轉移[5]。許多患者在術中并未發現淋巴結和遠處轉移，但不久之后腫瘤復發，可能與血液中或淋巴組織中的微小轉移灶有關。有研究表明CTCs可作為腫瘤標志物應用于臨床診斷[6]。通過檢測外周血中CTCs，可以對腫瘤轉移和復發進行早期診斷，并采取積極的治療措施，有助于延長患者生存期、提高患者生存質量。

1 循環腫瘤細胞的生物學特性

1.1 CTCs具有上皮間質轉化(EMT)與間質上皮轉換(MET)能力 EMT是指上皮細胞轉化具有間質細胞特性的過程，而間質細胞具有如運動能力強、侵襲性高、抗凋亡能力等特性。當腫瘤細胞由原發灶轉移至繼發灶時，CTCs經歷了EMT轉變，導致細胞的侵襲性增強，血管增多以及細胞存活能力增強[7]。

EMT參與腫瘤細胞浸潤和轉移可通過以下三種方式：減弱細胞間的聯系，降解細胞基質以及修飾細胞骨架。上皮細胞之間及上皮細胞與細胞外基質之間分別通過整合蛋白和鈣連接蛋白緊密相連，然后再通過細胞角蛋白和膠原蛋白加強這種聯系。當腫瘤發生浸潤或轉移時，腫瘤細胞失去了正常上皮細胞間的相互作用，表現出間質細胞的特征，即EMT，腫瘤細胞更容易侵入血管內皮進入循環系統，發生遠處轉移[8]。在EMT過程中，上皮細胞表達的上皮細胞粘附分子(EpCAM)、E-cadherin和細胞角蛋白(CK)下調，而表達間質細胞的標志物如波形蛋白和N-神經鈣黏素上調[9]。通過EMT，參與細胞間的緊密連接和黏附的分子表達降低，同時以波形蛋白為主的細胞骨架發生轉化，使細胞間黏附作用下降，運動能力增加，從而促使單個腫瘤細胞從腫瘤組織中脫落游走遷移至血管。此外，EMT還可產生促進基質金屬蛋白酶(MMP)[10]，通過MMP的作用對細胞基質進行降解，促進CTCs從腫瘤組織上皮表面釋放，便于CTCs滲透入血管[11]。

CTCs也可出現上皮細胞標志物和間質細胞標志物共表達，提示EMT和MET間可以發生相互轉化[12]，作為與EMT相反的生理過程，MET可增強細胞間的黏附性，減弱細胞的運動能力從而增強細胞的定植能力，還能促進細胞向上皮細胞轉變，因此CTCs在進行EMT的同時還可能發生MET，MET為CTCs的遠處定植及建立轉移提供便利條件。

1.2 CTCs聚集形成循環腫瘤微栓 進入到外周血液中的CTCs具有不同細胞類型，有上皮細胞表型、上皮細胞與間質細胞混合表型、間質細胞表型等[13]，其中以間質細胞表型CTCs轉移潛能最高。也可根據存在形式分為單個細胞(CTC)及聚集成團的循環腫瘤微栓(CTM)，其中以CTM的轉移潛能最強。

CTM又稱為循環腫瘤細胞集群(CTC clusters)。CTCs通常以單個細胞游走于血液循環中，侵入循環系統的CTCs受到血液物理作用的破壞以及機體自身免疫系統的吞噬殺傷作用，極少數可以在血液中存活，通過相互聚集成CTM發揮抗吞噬作用，從而提高存活能力[14]。研究表明，CTM腫瘤播散能力是CTCs的50倍以上，這可能與CTM具有抗凋亡能力，CTM中異質性細胞的相互作用，以及免疫耐受等作用有關[15]。

CTM是由一些CTC和非腫瘤細胞(輔助細胞)構成，其中輔助細胞包括上皮細胞，間質細胞，免疫細胞，血小板和一些纖維母細胞等。輔助細胞可以為腫瘤細胞生存提供支持，如纖維母細胞等，可以增加CTCs集群的穩定性，便于形成轉移灶，當去除CTM中部分纖維母細胞后，CTCs轉移播散能力明顯下降[16]。與單個CTCs相比，盡管CTM含量更少，但是CTM是腫瘤細胞的“集體遷移”結果，其抗凋亡能力更高、增殖能力更強以及具有逃避免疫殺傷能力從而具備更高的轉移潛能[17]。有研究顯示：CTM的轉移能力和耐藥性遠遠大于單個CTC[18]。

1.3 CTCs具有腫瘤干細胞(CSC)特性 腫瘤干細胞理論是在干細胞理論假說的基礎上提出來的。根據腫瘤干細胞理論：腫瘤細胞來源于基因突變的干細胞，具有無限分化增殖能力，并且能侵入到其他組織并擴散到全身各處[19-21]。

CSC是一類具干細胞特性的腫瘤細胞，可以長期存活，同時具有很強的運動和遷移能力。CTCs存在于腫瘤患者血液循環中，可能是作為CSC的一種特殊類型，具有一定的干細胞特性，在腫瘤發生和轉移過程中起重要作用[22]。但并不是所有的CTCs都能發生轉移，只有極少部分類似于干細胞特性的CTCs才能存活并轉移到遠處形成繼發病灶，這些細胞稱為循環腫瘤干細胞，具有自我更新、增殖的潛能，導致腫瘤發生和轉移。

2 CTCs的檢測技術

Steinert等[23]研究發現，腫瘤病人每天每克原發灶或轉移灶約有106個CTCs脫落進入外周血液中，而90%的CTCs通過血液物理作用、免疫損傷和凋亡而失去活力。CTCs在血液中含量極少，CTCs與正常血細胞的比值為(1/107)～(1/108)[24]，因此難以用常規的方法提取足夠量的CTCs，這限制了CTCs在臨床中的應用。

CTCs檢測分為富集及鑒定兩個步驟。富集是指利用細胞形態學或免疫學方法分選出腫瘤細胞。一種方法是利用血細胞與腫瘤細胞之間的形態學差異來分離CTCs，優點是細胞結構不被破壞，分離后的腫瘤細胞可接著進行免疫組織化學等方面的研究，此方法缺點是特異性較差，易出現假陽性，較少用；還有一種方法是采用免疫學方法進行分離：大部分來源于上皮的腫瘤細胞都表達上皮細胞黏附分子(EpCAM)以及細胞角蛋白(CK)等抗原，而血液中來源于骨髓的細胞則表達CD45等分子[25]。利用磁珠特異性結合抗原分選的方法，可從外周血中將CTCs分離富集出來。鑒定是指利用腫瘤表面或細胞核內特異性標志物對腫瘤細胞進行計數和特征分析。目前CTCs的鑒定有三種方法：一是于核酸檢測技術，即反轉錄PCR(RT-PCR)；二是熒光顯微技術；三是細胞免疫標記技術。核酸檢測技術是通過聚合酶鏈式反應擴增出腫瘤細胞相關的特異性標志物來證實腫瘤細胞的存在，該方法敏感度及特異度均較高，但是不足之處是假陽性率高，取血時容易受到上皮細胞的污染[26]。熒光顯微技術是指抗體經過熒光標記處理與特異性抗原結合，在顯微熒光鏡下可以直接觀察細胞形態。細胞免疫標記采用抗原抗體結合的方法鑒定CTCs，利用腫瘤細胞表達的一些特異性分子抗原，相比核酸檢測技術，細胞免疫標記是基于細胞內部特異性抗原的表達，敏感性低于RT-PCR。

因此為了提高敏感度和特異性，更加準確地分離并檢測分析CTCs，集富集、檢測和分析與一體的綜合系統逐漸應用于臨床，如CellSearch系統、CTCs芯片(CTCs-chip)。CellsearchTM系統已通過美國食品和藥物監督管理局(FDA)認證，可從7.5 mL的外周血中檢測到單一的腫瘤細胞[27]。此系統采用EpCAM抗體磁珠進行富集后，在外加強力磁場的作用下從血液中提取CTCs，并對分離出來的CTCs進行通透、固定，然后用DAPI熒光核染料、CD45熒光抗體和CK8/CK18/CK19熒光抗體標記細胞，最后采用半自動四色熒光顯微鏡Cell-Spotter Analyzer檢測分析篩選出CK8+/18+/19+、DAP1+、CD45-的細胞為CTCs。該方法可從400多億個血細胞中檢測到稀少的CTCs，目前已應用于肺癌、乳腺癌、前列腺癌等外周血的CTCs檢測，敏感性和特異性較高，但是檢測費昂貴，尚不能大規模推廣。

3 CTCs在肺癌診療中的研究進展

3.1 肺癌的早期診斷 近些年，在影像學檢查不能明確的情況下，腫瘤標志物對疾病嚴重程度的診斷評估起到重要作用，如PSA、AFP和CEA。然而仍有許多惡性腫瘤不具有可靠的蛋白質生物標志物，缺乏腫瘤診斷特異性標志物，加上目前技術的限制，導致其敏感性和特異性不高。此外，許多蛋白質生物標志物在血液循環中持續存在數周，因此需數周或數月后才能得到準確評估[28]。外周血中CTCs的含量水平與腫瘤分化程度和腫瘤大小密切相關，水平越高，患者預后相對越差。在肺癌形成和轉移的早期，如果在外周循環中檢測到脫落的CTCs，可以達到早發現，早診斷，并針對性治療。CTCs檢測相對于病理活檢達到了相對無創，被稱為“液態活檢”。Tanaka等[29]利用CellSearch系統比較125例肺癌和25例良性腫瘤的CTCs陽性率，發現肺癌(30.6%)的陽性率明顯高于良性腫瘤的陽性率(12%)，同時發現晚期以及發生肺癌轉移患者的CTCs含量明顯增高。接著研究人員通過檢測患者外周血CTCs的數量來鑒別原發肺腫瘤和肺部良性疾病，采用受試者工作特征(ROC)曲線將癌胚抗原(CEA)和CTCs的診斷價值進行比較，研究結果顯示：在鑒別肺癌和肺良性疾病方面，CTCs的診斷價值尚不如CEA(CTCs檢測ROC曲線下面積為0.598、CEA檢測ROC曲線下面積為0.747)，但是CTCs在預測遠處轉移方面有一定優勢，其特異度和陽性預測值分別為83.0%、89.7%，可見CTCs預測價值高于CEA。因此，監測CTCs特異性的改變可作為檢測早期肺癌和有效治療后殘留灶復發的指標，有利于治療決策[30]。

3.2 病情監測指導個體化治療 目前對肺癌患者病情監測的主要手段有影像學檢查，腫瘤標志物等血清學檢查以及臨床表現，然而目前的手段難以實時監測腫瘤的變化。相比穿刺或者手術獲取肺癌標本，CTCs的檢測具有實時性、相對無創性。可通過CTCs對肺癌患者病情進行監測并且指導治療方案的制定及更換，甚至對手術效果以及化療進行評價。在NSCLC(非小細胞肺癌)中，原發灶標本檢測EGFR呈陰性，在病情惡化后，有些患者外周血CTCs可以檢測到EGFR發生突變，而使用靶向藥物吉非替尼治療后，可以有效延長患者生存期，提高生活質量[31]。Carter等[32]研究顯示，外周血CTCs的檢測可以預測小細胞肺癌(SCLC)患者對治療的應答情況。研究人員在對31名小細胞肺癌患者的血液中分離CTCs進行研究發現，在外周血檢測到CTCs的基因改變與患者的化療耐藥有關，對外周血CTCs的檢測可以作為化療前預測小細胞肺癌患者對化療藥物是否敏感的生物學標志物。因此，實時監測CTCs的數目和分子特性可以有效反映患者病情變化，及時調整治療方案，達到個體化治療。

3.3 療效評估和預后判斷 腫瘤的組織學類型、TNM分期、以及臨床特征目前是對腫瘤患者進行預后判斷的主要依據，然而CTCs的含量水平與腫瘤生存期具有明顯相關性，可以利用CTCs這一優勢對肺癌等腫瘤患者進行預后評估。Hofman等[33]進行的一項大樣本前瞻性研究顯示，術前檢測CTCs數目可用來預測行根治性肺癌手術切除的Ⅰ～Ⅱ期NSCLC患者的無疾病進展期(DFS)與總體生存時間(OS)，對于術前CTCs>50個的患者其無疾病進展期(DFS)要更短一些，具有更高的復發風險。Muinelo-Romay等[34]納入43例NSCLC患者研究發現治療前、化療2周后、化療5周后的CTCs水平進行檢測，發現治療前CTCs計數為(18.9±14.8)/7.5 mL，化療后明顯降低，分別為(0.87±0.22)/7.5 mL、(0.77±0.42)/7.5 mL。此外，治療前CTCs≥5/7.5 mL的患者較CTCs<5/7.5 mL患者無進展生存期(PFS) (4.1個月，95%CI2.2～6；7.6個月，95%CI5.7～9.5) 及總生存率(OS)更短(4.6個月,95%CI2.5～6.8 ；10.7個月,95%CI8.6～12.8)。因此，通過監測肺癌患者外周血CTCs含量水平變化對病情療效判斷以及預后評估。

4 總結

CTCs通過腫瘤原發灶中脫落經歷EMT過程進入脈管系統，通過血管進入循環系統，克服循環系統中物理作用和各種免疫殺傷作用形成新的微小轉移灶并轉移到遠處器官的微血管，再從血液中滲出，經過MET轉變，在新的組織環境中存活，擴散最終形成遠處轉移灶。EMT-MET理論解釋腫瘤轉移和復發的過程，EMT及其相關分子參與到CTCs的許多生理步驟，深入研究CTCs以及CTM生理過程及其機制對于尋找新治療靶點，優化臨床治療方案，預后評估等方面均有重要意義。

腫瘤防治的關鍵是“三早”，即早發現、早診斷、早治療。早期治療不僅可以節約醫療費用，減少病人創傷，延長病人壽命，提高生活質量。因此，探尋可以早期診斷并能預測轉移、復發的檢測方法對于提高腫瘤患者生存率、改善預后至關重要。CTCs的濃度能實時、動態反映疾病的進程，可用于肺癌的早期診斷、病情監測、評估預后。CTCs的檢測易獲取、可重復、相對無創，被稱為“液體活檢”。通過對外周血液中CTCs數量及類型檢測，監測腫瘤動態進展，進行療效評估，甚至可以對CTCs進行基因檢測，指導肺癌個體化治療。雖然CTCs檢測具有很好的臨床應用前景，但目前仍存在問題：雖已證實檢測出CTCs與腫瘤預后具有一定的相關性，但是檢測出CTCs并不代表腫瘤一定會復發或轉移，因此需要尋找高轉移潛能的CTCs亞群；研發出更高敏感性和特異性的檢測技術仍是應用于臨床的關鍵；采用簡便、價格低廉的方法，將有助于CTCs的檢測盡快進入臨床。

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