產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖的工程菌構(gòu)建、發(fā)酵及應(yīng)用研究進(jìn)展

秦志杰，岳秋林*，劉新利

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353）

N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyleneglucosamine，GlcNAc）是一種氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）的衍生物，是生物體內(nèi)多種多糖的基本組成單位，也是合成雙歧因子的重要前體，易溶于水，具有還原性，在生物體內(nèi)具有重要的生理功能。GlcNAc廣泛存在于自然界中，于動物體、植物體、細(xì)菌和真菌中均有存在，是幾丁質(zhì)和殼聚糖的主要成分[1-3]。GlcNAc主要應(yīng)用于食品保健、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域，需求量大，市場廣闊。作為膳食補(bǔ)充劑，GlcNAc具有保護(hù)軟骨組織及骨關(guān)節(jié)作用；作為藥品，GlcNAc在治療炎癥性腸病方面表現(xiàn)出明顯功效。同樣因其能夠提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用，可起到延長細(xì)胞壽命的作用[4]。在歐美等發(fā)達(dá)國家，GlcNAc己經(jīng)作為膳食補(bǔ)充劑而被廣泛應(yīng)用[5]。GlcNAc的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法主要采取甲殼素水解法，該方法在原料供應(yīng)、環(huán)境保護(hù)及產(chǎn)品安全方面存在許多潛在問題[3，6]，首先，以蝦、蟹殼中的甲殼素作為原料，隨著GlcNAc市場需求的日益增加，原料供給可能出現(xiàn)短缺，導(dǎo)致GlcNAc市場供應(yīng)不足；其次，如今甲殼素水解法采用酸水解，GlcNAc生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量廢水，嚴(yán)重污染環(huán)境；最后，來源于蝦、蟹殼的GlcNAc可能使對海產(chǎn)品過敏的人群產(chǎn)生過敏反應(yīng)[7]。因此，食品安全級的、非甲殼類動物來源的GlcNAc是目前消費者需求的產(chǎn)品。微生物發(fā)酵法不受原料來源的季節(jié)和地域限制，生產(chǎn)效率高，污染小，而且不會產(chǎn)生過敏反應(yīng)。因此，微生物發(fā)酵法具有可持續(xù)性的重大社會經(jīng)濟(jì)效益，構(gòu)建高效生產(chǎn)GlcNAc的基因工程菌，采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GlcNAc可有效解決其傳統(tǒng)生產(chǎn)方法所帶來的諸多問題[8]。現(xiàn)如今國內(nèi)外研究較深入的生產(chǎn)GlcNAc的基因工程菌主要為大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。在這些工程菌的構(gòu)建中，基礎(chǔ)的思路都是過表達(dá)GlcNAc合成途徑的關(guān)鍵酶基因，敲除降解途徑的關(guān)鍵酶基因以及主要副產(chǎn)物的合成酶基因。近些年，隨著代謝工程的不斷發(fā)展，支架介導(dǎo)途徑、模塊化工程、動態(tài)調(diào)控、代謝組學(xué)分析等方法逐漸應(yīng)用于工程菌的構(gòu)建中以提高GlcNAc的產(chǎn)量，高效生產(chǎn)GlcNAc的基因工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵在工業(yè)化生產(chǎn)中表現(xiàn)出了巨大的潛力和吸引力。

隨著GlcNAc市場需求的日益增加，存在諸多潛在問題的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法所生產(chǎn)的GlcNAc在產(chǎn)量及品質(zhì)上漸漸不能滿足人們的需求，構(gòu)建高產(chǎn)GlcNAc的工程菌給人們指出了新方向，并顯示出了巨大潛力。本文主要從產(chǎn)GlcNAc的工程菌的構(gòu)建與GlcNAc應(yīng)用現(xiàn)狀方面進(jìn)行了整理綜述，并展望了其重點的研究方向，以期為GlcNAc的發(fā)酵生產(chǎn)及廣泛應(yīng)用提供支持。

1 GlcNAc工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵

1.1 大腸桿菌產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵

大腸桿菌因易于培養(yǎng)、生長周期短、遺傳背景清晰、遺傳操作技術(shù)簡便成熟等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于代謝工程的改造，并被用于發(fā)酵生產(chǎn)許多有經(jīng)濟(jì)價值的化合物[9]。

2005年DENG M D等[10]使用一系列代謝工程策略構(gòu)建了一株產(chǎn)GlcN和GlcNAc的高性能的重組大腸桿菌菌株。首先，使用易錯聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（error-pronepolymerasechain reaction，epPCR）進(jìn)行氨基葡萄糖合成酶（glucosamine synthase，GlmS）的定向進(jìn)化，并獲得了解除產(chǎn)物抑制的GlmS，并證明過表達(dá)突變體GlmS可有效增加GlcN產(chǎn)量，使GlcN質(zhì)量濃度達(dá)到了75 mg/L水平。然后，T7lac-ScGNA1的表達(dá)盒被整合在manXYZ基因座上，整個nagBACD操縱子和乙酰氨糖轉(zhuǎn)運基因nagE的一部分被替換為四環(huán)素抗性基因tetR，使GlcN產(chǎn)量達(dá)到了17 g/L。最后，為了避免GlcN的快速降解并緩和GlcN及其降解產(chǎn)物對宿主細(xì)胞的抑制作用，過表達(dá)了異源的GlcN-6-磷酸（phosphate，P）乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（GNA1）以延伸途徑至GlcNAc，因為GlcNAc是一種在大腸桿菌宿主內(nèi)穩(wěn)定和惰性的氨基糖。最終以葡萄糖為合成GlcNAc的底物，在1 L罐的流加方式下，經(jīng)過誘導(dǎo)和條件優(yōu)化后，于發(fā)酵72 h時，構(gòu)建好的菌株GlcNAc產(chǎn)量達(dá)到了110 g/L。DENG M D等的工作解除了GlcN-6-P對氨基葡萄糖合成酶的抑制以及氨基葡萄糖和它的降解產(chǎn)物對宿主細(xì)胞的抑制效應(yīng)，并且進(jìn)一步阻斷了GlcN和GlcNAc向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運進(jìn)而阻止其作為碳、氮源的胞內(nèi)降解利用，為后續(xù)生產(chǎn)GlcNAc基因工程菌的構(gòu)建提供了基礎(chǔ)思路和方向指導(dǎo)。

除了在在宿主菌中對其合成途徑和轉(zhuǎn)運途徑進(jìn)行基因工程改造外，宿主菌的培養(yǎng)條件對提高乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量也十分重要。2012年，陳欣等[11]通過過表達(dá)氨基葡萄糖（GlcN）合成酶基因和GlcN-6-P乙酰轉(zhuǎn)移酶基因構(gòu)建了有效生產(chǎn)GlcN和GlcNAc的重組大腸桿菌。并運用Red同源重組技術(shù)敲除其轉(zhuǎn)運子編碼基因nagE與manX，培養(yǎng)雙基因敲除菌株至10 h時，GlcN產(chǎn)量達(dá)到了最大值4.82 g/L，同時GlcNAc產(chǎn)量達(dá)到了最大值118.78 g/L，分別是對照菌株的1.2倍和2.86倍。該結(jié)果表明，轉(zhuǎn)運子編碼基因nagE與manX的敲除可顯著降低胞外的GlcN與GlcNAc向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，從而提高GlcN與GlcNAc在發(fā)酵液中的積累量。并對恒速補(bǔ)料、間歇補(bǔ)料和指數(shù)補(bǔ)料這3種不同的葡萄糖補(bǔ)料策略對GlcN和GlcNAc產(chǎn)量的影響進(jìn)行了研究，以進(jìn)一步增強(qiáng)GlcN和GlcNAc生產(chǎn)。該研究構(gòu)建了有效生產(chǎn)GlcN和GlcNAc的重組大腸桿菌，通過使用重組菌E.coli-glmS-GNA1研究了葡萄糖補(bǔ)料策略（恒速補(bǔ)料、間歇補(bǔ)料和指數(shù)補(bǔ)料）及溶氧水平對GlcN和GlcNAc生產(chǎn)的影響，并開發(fā)了多級葡萄糖供應(yīng)策略。而且其開發(fā)的時間依賴的葡萄糖補(bǔ)料方法可能對重組大腸桿菌生產(chǎn)其他精細(xì)化學(xué)品同樣適用。

1.2 枯草芽孢桿菌產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵

大腸桿菌工程菌相對于傳統(tǒng)甲殼素水解法表現(xiàn)出了巨大優(yōu)勢及應(yīng)用潛力，然而，E.coli作為工業(yè)化生產(chǎn)宿主存在以下不足：首先，因為E.coli不是食品安全級菌株，使得E.coli來源的GlcNAc應(yīng)用領(lǐng)域有限。其次，E.coli易在發(fā)酵過程中受噬菌體污染，在工業(yè)規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中不適用。因此，適合于工業(yè)規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)的食品安全級菌株是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GlcNAc的理想菌株。許多通常被認(rèn)為安全的微生物菌株（generally regarded as safe，GRAS）已被鑒定，并被開發(fā)用于營養(yǎng)保健品的合成，而且已經(jīng)利用這些菌株實現(xiàn)了許多重要營養(yǎng)制品的生產(chǎn)[12]。枯草芽孢桿菌發(fā)酵工藝成熟、遺傳背景清晰、基因操作技術(shù)成熟并且不易受噬菌體污染，被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)以生產(chǎn)透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、核黃素等各種化合物，B.subtilis是一種重要的食品安全級工業(yè)生產(chǎn)菌株[13-15]。因此，B.subtilis是生產(chǎn)GlcNAc的理想宿主。

劉延峰等[16]構(gòu)建了重組枯草芽孢桿菌菌株以提高GlcNAc生產(chǎn)。使用基因工程，將基因GlmS和Gna1共同過表達(dá)以增強(qiáng)GlcNAc的合成，同時敲除基因nagP、nagA、gamA和nagB以阻止GlcNAc的降解。在3 L補(bǔ)料分批生物反應(yīng)器中獲得了5.19g/L的GlcNAc產(chǎn)量[17]。然后通過基于脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）引導(dǎo)的支架系統(tǒng)的空間調(diào)控控制關(guān)鍵酶Gan1和GlmS的比例為2∶1，增強(qiáng)了關(guān)鍵途徑中氨基葡萄糖合成酶與GlcN-6-P乙酰轉(zhuǎn)移酶的酶活。通過基因spo0A和sigE的敲除阻斷了孢子形成。此外，通過呼吸鏈工程敲除了編碼細(xì)胞色素的基因以減少維持新陳代謝的需求。這些方法將GlcNAc的產(chǎn)量提高到了20.58g/L[18]。為了進(jìn)一步提高GlcNAc產(chǎn)量，將GlcNAc合成相關(guān)的代謝網(wǎng)絡(luò)中的糖酵解途徑、肽聚糖合成途徑以及N-乙酰氨基葡萄糖合成途徑三個模塊，通過模塊化工程進(jìn)行了優(yōu)化組裝。最終改造后的枯草芽孢桿菌在3 L發(fā)酵罐進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，葡萄糖初始含量為20 g/L。通過這種補(bǔ)料分批發(fā)酵方式，GlcNAc產(chǎn)量達(dá)到了31.65 g/L[19]。

朱妍荻[20]以一株可合成GlcNAc的重組枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株，通過單敲除prophage1、prophage3、skin、PBSX和pks五個區(qū)域的非必需基因組片段，進(jìn)一步提高細(xì)胞代謝效率和GlcNAc合成效率，并在此基礎(chǔ)上，對重組枯草芽孢桿菌合成GlcNAc的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，將葡萄糖含量控制在5g/L進(jìn)行溶氧分階段調(diào)控（0～7h，30%；7～15h，50%；15～50 h，40%；50～72 h，30%）。在此條件下，GlcNAc產(chǎn)量提高到了35.77g/L，顯著提高了GlcNAc的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度。

1.3 其他生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵

在其他食品安全菌株中，很多研究者同樣做出了構(gòu)建生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖工程菌的嘗試并取得了一定進(jìn)展。

王雅婷等[5]嘗試構(gòu)建了一株新的基因工程菌谷氨酸棒狀桿菌來生產(chǎn)GlcNAc。通過增強(qiáng)GlcNAc的合成途徑，并敲掉GlcNAc的消耗代謝途徑及主要副產(chǎn)物合成途徑，使得構(gòu)建的工程菌glmS-gnal-C.g-△nagAB在250 mL搖瓶發(fā)酵體系中GlcNAc產(chǎn)量達(dá)到1.43 g/L左右；隨后將合成副產(chǎn)物乳酸的乳酸脫氨酶基因ldh敲掉，使得glmS-gnal-C.g-△nagAB△ldh生產(chǎn)GlcNAc能力達(dá)到2.23 g/L，副產(chǎn)物乳酸濃度幾乎為0；實驗結(jié)果證明了構(gòu)建谷氨酸棒狀桿菌工程菌生產(chǎn)GlcNAc的可行性。

LEE S W等[21]通過過表達(dá)無變構(gòu)調(diào)節(jié)的Gfa1p突變體和像鹵代酸脫鹵素酶的磷酸酶YqaB證明了GlcNAc在釀酒酵母中的生產(chǎn)，并進(jìn)一步降低糖酵解通量提高了GlcNAc產(chǎn)量。并發(fā)現(xiàn)真核磷酸果糖激酶1被果糖2,6-二磷酸變構(gòu)激活。合成F26BP的PFK-2的破壞，導(dǎo)致GlcNAc產(chǎn)量的輕度降低并且葡萄糖消耗量和乙醇產(chǎn)量沒有顯著變化。但是，當(dāng)使用半乳糖作為無PFK-2菌株的唯一碳源時，GlcNAc產(chǎn)量明顯增加并且乙醇產(chǎn)量減少，這表明可以使糖酵解通量進(jìn)一步降低以提高GlcNAc產(chǎn)量。

2 GlcNAc應(yīng)用現(xiàn)狀

GlcNAc屬于氨基糖的一個大類，具有許多功能，如除了用作營養(yǎng)補(bǔ)充劑外，GlcN還被用于食品和運動飲料以生產(chǎn)用于關(guān)節(jié)健康的功能性食品，并用于化妝品中改善皮膚水分[22]。GlcNAc及其類似物（如幾丁質(zhì)和殼聚糖），可作為生物的碳或氮源。實際上，它們也可以用作生物質(zhì)，已有研究顯示粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）能夠?qū)lcNAc轉(zhuǎn)化為生物燃料。GlcNAc也是糖蛋白，蛋白多糖，粘多糖和其他結(jié)締組織構(gòu)件的組分，而粘多糖和糖蛋白是組織修復(fù)和抗炎反應(yīng)的底物材料，于是人們發(fā)現(xiàn)GlcNAc也是治療多種疾病的十分有價值的藥劑[23]。

2.1 GlcNAc在食品領(lǐng)域的應(yīng)用

GlcNAc溶解后可明顯抑制一些細(xì)菌和真菌的生長且具有一定成膜性，將其涂于果蔬表面形成薄膜，可以抑制果蔬失水速率及其呼吸強(qiáng)度，減緩營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，同時具有抑制微生物的侵染，減緩果蔬的腐爛，增加保藏時間的功能，從而達(dá)到保鮮目的[24]。因此GlcNAc可作為一種天然的抗菌劑和保鮮劑在食品保藏中發(fā)揮作用。GlcNAc還可與肉類食品在加熱處理時從肉的血紅蛋白中釋放的鐵離子形成螯合物，從而抑制鐵離子的催化活性，起到抗氧化的作用，進(jìn)而解決肉類食品中因含有高度易被氧化的不飽和脂肪酸，而使肉類食品容易腐敗變質(zhì)的問題。果汁中含有大量帶負(fù)電荷的纖維素、果膠、多聚戊糖等物質(zhì)，在存放期間很容易使果汁變渾濁。當(dāng)上述負(fù)電荷物質(zhì)和具有正電荷的GlcNAc吸附絮凝后，再經(jīng)處理后的澄清果汁是一個穩(wěn)定的熱力學(xué)體系，所以能長期存放，不產(chǎn)生渾濁，因而GlcNAc亦可用作果汁、酒類等的澄清劑[25]。因為GlcNAc熱量低、保健機(jī)能好，且被食用后血糖不會升高，可以作為糖尿病人和肥胖者的理想甜味劑；GlcNAc能夠促進(jìn)乳酸菌及雙岐桿菌的生長，因此可將其添加到乳制品中，促進(jìn)菌體生長繁殖；GlcNAc制成保健品可以減少人體腸道內(nèi)有害菌群，增加有益菌群，調(diào)節(jié)菌群的分布，從而調(diào)整腸道內(nèi)的微生態(tài)環(huán)境[26]。

2.2 GlcNAc在醫(yī)療方面的應(yīng)用

關(guān)節(jié)軟骨的基質(zhì)為蛋白聚糖、軟骨細(xì)胞和膠原蛋白，它可緩沖來自機(jī)械力的沖擊，并提供一個光滑的骨表面，使骨頭之間可以很容易滑過而不摩擦損傷。缺乏蛋白多糖前體和滑液會導(dǎo)致骨骼關(guān)節(jié)的結(jié)構(gòu)和功能缺陷并發(fā)生骨關(guān)節(jié)炎。發(fā)病率隨著年齡增長而增加，多發(fā)于65歲以上人群[23]。GlcNAc是軟骨組織及關(guān)節(jié)液等的關(guān)鍵組成物質(zhì)，GlcNAc能夠再生并修復(fù)軟骨組織，且能防止軟骨組織遭受損傷，具有重要的藥用效果。臨床實驗結(jié)果表明，GlcNAc不僅具有改善骨關(guān)節(jié)炎的作用，同時還有控制病情的作用[27]。GlcNAc也可以誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的分化，很可能成為新的低毒、高效治療白血病的候選藥物[28]。另有研究表明，在白酒中加入GlcNAc后，肝組織及腸黏膜組織的損傷均有不同程度緩解，推測GlcNAc減輕乙醇對肝臟的損傷可能與GlcNAc恢復(fù)腸黏膜上皮細(xì)胞功能、穩(wěn)定腸道黏膜屏障功能、抑制腸內(nèi)細(xì)菌穿透腸上皮進(jìn)入血液循環(huán)及內(nèi)毒素入血有關(guān)。因此，GlcNAc可以緩解酒精對肝臟與腸道的損傷與破壞，對機(jī)體起到保護(hù)作用[29]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，GlcNAc可以激活鈣信號通路，誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖，從而使T細(xì)胞在細(xì)胞免疫的過程中活化并特異性的攻擊帶有相應(yīng)抗原的腫瘤細(xì)胞，從而實現(xiàn)抗腫瘤的目的[5]。GlcNAc的抗菌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抑制腫瘤細(xì)胞生長等特性，使其在醫(yī)療領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的市場潛力[30]。

2.3 GlcNAc在化妝品方面的應(yīng)用

人體皮膚含有角質(zhì)層和真皮層，用以保護(hù)身體免受干燥和紫外線照射等惡劣的環(huán)境條件損傷。角質(zhì)層在維持皮膚的水分和緊致方面起著關(guān)鍵作用。它由扁平化的死細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞以及脂質(zhì)基質(zhì)和天然水分因子的復(fù)合物組成。真皮是皮膚的內(nèi)層，由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的膠原蛋白、彈性蛋白和粘多糖組成[23]。膠原蛋白是健康肌膚保持彈性，強(qiáng)度，光滑度和豐滿外觀的原因。粘多糖（如透明質(zhì)酸和蛋白聚糖）具有高保水能力，并且是保持皮膚水分的重要組分。透明質(zhì)酸主要由成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生，是一種眾所周知的能將角質(zhì)層和真皮水分保留的成分[23]。GlcNAc可以促進(jìn)人體內(nèi)蛋白聚糖的代謝合成，并提高在人體肌膚中透明質(zhì)酸的含量，透明質(zhì)酸吸收水分后，使得彈力纖維及膠原蛋白處在充分濕潤的環(huán)境中，從而維持細(xì)胞外基質(zhì)的彈性，因此GlcNAc具有延緩肌膚衰老的功效，被添加在許多化妝品中以起到加強(qiáng)保濕的功效[20]。另外，BISSETT D L等[31]研究發(fā)現(xiàn)，口服天然GlcNAc能加強(qiáng)透明質(zhì)酸在體內(nèi)的合成，改善皮膚水潤程度。國內(nèi)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，GlcNAc能夠抑制細(xì)胞內(nèi)黑色素的形成，具有開發(fā)美白化妝品的潛力[32]。

3 結(jié)論與展望

目前構(gòu)建的大腸桿菌工程菌雖然得到了較高產(chǎn)量的GlcNAc，但因大腸桿菌并非食品安全菌株，使其工業(yè)化生產(chǎn)受到限制。枯草芽孢桿菌作為遺傳背景清晰、發(fā)酵工藝成熟、基因操作技術(shù)成熟并且不易受噬菌體污染的常用工業(yè)菌株，是生產(chǎn)GlcNAc的更好選擇，但其目前產(chǎn)量不高，谷氨酸棒狀桿菌工程菌及釀酒酵母工程菌面臨著同樣的問題。利用動態(tài)調(diào)控元件、代謝組學(xué)、動力學(xué)分析等手段進(jìn)一步確定GlcNAc合成途徑中的限速步驟并解除無效循環(huán)以提升枯草芽孢桿菌生產(chǎn)GlcNAc的能力仍然需要大量的研究。同時，溶氧水平等發(fā)酵條件的優(yōu)化同樣對提高GlcNAc產(chǎn)量具有重要意義。

[1]ASHRY E S H,ALY M R E.Synthesis and biological relevance of N-acetylglucosamine-containing oligosaccharides[J].Pure Appl Chem,2007,79(12):2229-2242.

[2]YADAV V,PANILAITIS B,SHI H,et al.N-acetylglucosamine 6-phosphate deacetylase(nagA)is required for,N-acetyl glucosamine assimilation in gluconacetobacter xylinus[J].Plos One,2011,6(6):e18099.

[3]CHEN J K,SHEN C R,YEH C H,et al.N-Acetyl glucosamine obtained from chitin by chitin degrading factors inChitinbacter tainanesis[J].Int J Mol Sci,2011,12(2):1187-1195.

[4]WEIMER S,PRIEBS J,KUHLOW D,et al.D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice[J].Nat Commun,2014,5(4):3563.

[5]王雅婷.生物法合成N-乙酰氨基葡萄糖[D].北京：北京化工大學(xué)，2016.

[6]HULIKOVA K,SVOBODA J,BENSON V,et al.N-acetyl-D-glucosaminecoated polyamidoamine dendrimer promotes tumor-specific B cell responses via natural killer cell activation[J].Int Immuno Pharm,2011,11(8):955-961.

[7]DENG M D,SEVERSON D K,GRUND A D,et al.Metabolic engineering ofEscherichia colifor industrial production of glucosamine and N-acetylglucosamine[J].Metab Eng,2005,7(3):201-214.

[8]王 升，李丕武，劉佃磊，等.利用發(fā)酵法生產(chǎn)氨基葡萄糖的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報，2014（1）：68-74.

[9]王俊明.利用重組大腸桿菌和核糖開關(guān)進(jìn)行L-賴氨酸生產(chǎn)的研究[D].濟(jì)南：山東大學(xué)，2015.

[10]DENG M D,ANGERER D J,CYRON D,et al.Process and materials for production of glucosamine and N-acetylglucosamine:US8124381[P].2012-2-28.

[11]陳 欣.代謝工程改造大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基葡萄糖及過程優(yōu)化與控制[D].無錫：江南大學(xué)，2012.

[12]LIU L,GUAN N,LI J,et al.Development of GRAS strains for nutraceutical production using systems and synthetic biology approaches:advances and prospects[J].Crit Rev Biotechnol,2015,37(2):1-12.

[13]DIJL J M V,HECKER M.Bacillus subtilis:from soil bacterium to super-secreting cell factory[J].Microb Cell Fact,2013,12(1):3.

[14]LIU L,LIU Y,SHIN H D,et al.DevelopingBacillusspp.as a cell factory for production of microbial enzymes and industrially important biochemicals in the context of systems and synthetic biology[J].Appl Microbiol Biotechnol,2013,97(14):6113-6127.

[15]MEYER F M,GERWIG J,HAMMER E,et al.Physical interactions between tricarboxylic acid cycle enzymes inBacillus subtilis:evidence for a metabolon[J].Metab Eng,2011,13(1):18-27.

[16]劉延峰.代謝工程改造枯草芽孢桿菌高效合成N-乙酰氨基葡萄糖[D].無錫：江南大學(xué)，2015.

[17]LIU Y,LIU L,SHIN H D,et al.Pathway engineering ofBacillus subtilis for microbial production of N-acetylglucosamine[J].Metab Eng,2013,19(5):107-115.

[18]LIU Y,ZHU Y,MA W,et al.Spatial modulation of key pathway enzymes by DNA-guided scaffold system and respiration chain engineering for improved N-acetylglucosamine production byBacillus subtilis[J].Metab Eng,2014,24(1):61-69.

[19]LIU Y,ZHU Y,LI J,et al.Modular pathway engineering ofBacillus subtilisfor improved N-acetylglucosamine production[J].Metab Eng,2014,23(5):42-52.

[20]朱妍荻.枯草芽孢桿菌代謝調(diào)控及過程優(yōu)化生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖[D].無錫：江南大學(xué)，2015.

[21]LEE S W,OH M K.Improved production of N-acetylglucosamine in Saccharomyces cerevisiaeby reducing glycolytic flux[J].Biotechnol Bioeng,2016,113(11):2524-2528.

[22]LIU L,LIU Y,SHIN H D,et al.Microbial production of glucosamine and N-acetylglucosamine:advances and perspectives[J].Appl Microbiol Biotechnol,2013,97(14):6149-6158.

[23]CHEN J K,SHEN C R,LIU C L.N-acetylglucosamine:Production and applications[J].Marine drugs,2010,8(9):2493-2516.

[24]池亞斌.枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖條件優(yōu)化控制研究[D].無錫：江南大學(xué)，2016.

[25]姬小明，王建玲.甲殼素和殼聚糖及其衍生物在食品工業(yè)中應(yīng)用新進(jìn)展[J].平原大學(xué)學(xué)報，2003，20（4）：6-7.

[26]徐小芳.乙酰氨基葡萄糖合成關(guān)鍵酶GlmS和Gna1的篩選及催化動力學(xué)分析[D].無錫：江南大學(xué)，2016.

[27]沈若武，龔少蘭，王守彪，等.N-乙酰氨基葡萄糖對骨折愈合的實驗性研究[J].中國臨床解剖學(xué)雜志 ，2004，22（4）：394-397.

[28]王 哲，喬 巖.N-乙酰氨基葡萄糖誘導(dǎo)白血病細(xì)胞K562向巨噬細(xì)胞分化[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2003，24（1）：46-48.

[29]趙 瑩，吳小蘭，郭林明，等.N-乙酰氨基葡萄糖對乙醇致肝組織損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制[J].吉林大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2011，37（3）：456-459.

[30]龔福明，何彩梅，唐小艷，等.微生物幾丁質(zhì)酶的研究進(jìn)展及應(yīng)用現(xiàn)狀[J].中國釀造，2017，36（8）：20-25.

[31]BISSETT D L.Glucosamine:an ingredient with skin and other benefits[J].J Cosmet Dermatol,2010,5(4):309-315.

[32]金宛宛，張榮鑫，林 茂，等.N-乙酰氨基葡萄糖對小鼠B16黑素瘤細(xì)胞凋亡的影響[J].中國生物美容，2009（4）：5-9.