臨床分離萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌van基因型及分子分型

周 迎， 楊 洋， 郭 燕， 鄭永貴， 吳 湜， 徐曉剛

萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌（vancomycin-resistant Enterococcus，VRE）已經(jīng)逐漸成為醫(yī)院感染的重要病原菌，可引起尿路、腹腔、傷口感染，以及血流感染、心內(nèi)膜炎等嚴(yán)重感染性疾病。中國(guó)大陸地區(qū)VRE主要攜帶vanA和vanM 兩型耐藥基因簇[1-2]，vanA與vanM耐藥基因簇均屬于D-丙氨酸：D-乳酸連接酶（D-Ala：D-Lac ligase）基因簇，常介導(dǎo)宿主菌對(duì)萬(wàn)古霉素等糖肽類抗菌藥物耐藥。本研究對(duì)2016年分離自上海地區(qū)6所醫(yī)院的17株VRE進(jìn)行耐藥基因及多位點(diǎn)序列分型（MLST）分析，為此類耐藥菌感染防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 17株VRE均于2016年分離自上海地區(qū)。vanM基因型VRE陽(yáng)性對(duì)照株Efm-HS0661以及質(zhì)控菌株糞腸球菌ATCC29212均為本研究所保存菌種。vanA基因型VRE參考菌株由香港中文大學(xué)凌建華博士惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑及儀器 Mueller-Hinton 瓊脂、Columbia 瓊脂、BHI瓊脂及肉湯（OXOID，英國(guó)）；陽(yáng)離子調(diào)節(jié)MH肉湯（Cation-Adjusted Mueller Hinton II Broth， CAMHB）（BD，美國(guó)）。氨芐西林、左氧氟沙星、萬(wàn)古霉素、紅霉素、克林霉素、利奈唑胺、甲氧芐啶-磺胺甲唑、替考拉寧、呋喃妥因和利福平等藥敏卡購(gòu)自溫州康泰公司。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；限制性內(nèi)切酶TaKaRa Ex Taq、TaKaRa Taq? HS PCR Kit（UNG plus）及PCR儀購(gòu)自大連寶生物公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖、電泳系統(tǒng)及凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌種確認(rèn) 根據(jù)參考文獻(xiàn)合成通用引物8F、1492R[3]，擴(kuò)增17株臨床分離VRE的16S rRNA基因，測(cè)序后與GenBank序列進(jìn)行比對(duì)，以進(jìn)一步確認(rèn)菌種。

1.2.2 藥敏試驗(yàn) 采用微量肉湯稀釋法測(cè)定VRE對(duì)氨芐西林、左氧氟沙星、萬(wàn)古霉素、紅霉素、克林霉素、利奈唑胺、甲氧芐啶-磺胺甲唑、替考拉寧、呋喃妥因和利福平的MIC值。采用瓊脂稀釋法測(cè)定磷霉素對(duì)VRE的MIC值。根據(jù)CLSI 2017版標(biāo)準(zhǔn)[4]對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀。

1.2.3 DNA模板制備和MLST分型 將凍存菌株轉(zhuǎn)種哥倫比亞血平皿，37?℃過(guò)夜培養(yǎng)后挑取菌落至已注入500 μL TE（pH8.0）的1.5 mL Eppendorf離心管，調(diào)節(jié)菌液濁度至2麥?zhǔn)蠁挝唬?00?℃ 加熱10 min后5 000 g離心5 min取上清液備用。

擴(kuò)增屎腸球菌基因組上的7個(gè)管家基因：AtpA、Ddl、Gdh、Purk、Gyd、PstS和Adk，將PCR產(chǎn)物純化后測(cè)序。參照屎腸球菌MLST分型數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//efaecium.mlst.net/）提供的步驟進(jìn)行MLST分型。

1.2.4 van基因分型 參照參考文獻(xiàn)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增[5]，擴(kuò)增所需引物見表1。PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠，電壓6 V/cm電泳30 min后染色讀取結(jié)果。

表1 本研究所采用的PCR引物Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果

2.1VRE臨床株菌種鑒定及藥敏測(cè)定

17株VRE臨床株經(jīng)16S rRNA基因測(cè)序確認(rèn)均為屎腸球菌。常用抗菌藥物對(duì)17株臨床分離VRE的MIC結(jié)果見表2。本研究所測(cè)VRE對(duì)萬(wàn)古霉素及替考拉寧耐藥率高，分別為100%（17/17）和70.6%（12/17）；但對(duì)于磷霉素和甲氧芐啶-磺胺甲唑耐藥率低，分別為29.4%和5.8%；所有分離株對(duì)利奈唑胺均敏感。

2.2 VRE臨床分離株van基因分型

17株VRE中，13株檢出vanA基因，9株檢出vanM基因，其中5株同時(shí)檢出vanA和vanM基因，見圖1。

2.3VRE臨床分離株MLST分型

通過(guò)MLST分型，17株VRE中ST78型8株（47.1%）、ST80型4株（23.5%）、ST555型2株（11.8%），其余3株分別為ST117型、ST262型和ST341型。分型結(jié)果顯示，2016年上海地區(qū)分離VRE以ST78型為主。

3 討論

VRE自1988年首次報(bào)道以來(lái)[6]，已在全球播散，成為最重要的醫(yī)院感染病原菌之一。VRE對(duì)醫(yī)院內(nèi)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)[7]，且治療藥物有限。VRE的耐藥性可通過(guò)攜帶耐藥基因的移動(dòng)元件在腸球菌屬細(xì)菌中傳播，甚至跨種屬傳播，例如傳遞至致病性更強(qiáng)的金黃色葡萄球菌，產(chǎn)生萬(wàn)古霉素耐藥金黃色葡萄球菌。根據(jù)2009年至2012年美國(guó)國(guó)家醫(yī)療安全監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)（NHSN）數(shù)據(jù)顯示[8]，腫瘤患者血流感染的主要病原菌中，腸球菌（11.4%）僅次于凝固酶陰性葡萄球菌和大腸埃希菌位列第3，其中耐萬(wàn)古霉素屎腸球菌占82.5%。VRE在中國(guó)地區(qū)耐藥率一直較低，但是近年來(lái)有逐年增多的趨勢(shì)。根據(jù)2005－2014年CHINET耐藥性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，屎腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素的耐藥率由0.6%上升至4.2%[9]。

表2 17株萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌基因型及其對(duì)抗菌藥物的敏感性Table 2 Genotypes and antimicrobial susceptibility of 17 vancomycin-resistant Enterococcus strains

圖1 van基因PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Figure 1 Agarose gel electrophoresis of van gene PCR products

根據(jù)VRE耐藥表型和van基因簇結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，已有9型腸球菌van基因型被命名，分別是vanA、vanB、vanC、vanD、vanE、vanG、vanL、vanM和vanN[10-11]。它們對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉寧的耐藥水平各不相同，但是耐藥機(jī)制相似：通過(guò)合成與萬(wàn)古霉素親和力下降的新細(xì)胞壁前體而形成耐藥。vanA、vanB、vanD和vanM型介導(dǎo)VRE菌株產(chǎn)生含D-丙氨酸-D-乳酸（D-Ala-D-Lac）末端的細(xì)胞壁前體，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)萬(wàn)古霉素高度耐藥（MIC≥64 mg/ L）。國(guó)外流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，vanA及vanB型最為常見[12]，但我國(guó)分離VRE的基因型有所不同，主要為vanA型，vanB型少見。上海地區(qū)vanM較為常見[1-2]。

我們前期已建立一種基于多重PCR技術(shù)的VRE萬(wàn)古霉素高水平耐藥基因快速分型方法[5]，對(duì)2016年上海地區(qū)臨床分離的17株VRE進(jìn)行van基因及分子分型。分型結(jié)果顯示臨床分離株中van基因型僅有vanA和vanM型兩型，首次發(fā)現(xiàn)同時(shí)攜帶vanA及vanM 的VRE菌株。對(duì)VRE菌株進(jìn)行進(jìn)一步藥敏分析，結(jié)果顯示，17株VRE菌株均對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥，但對(duì)替考拉寧耐藥率僅為70.6%（12/17）。本研究已對(duì)這些VRE菌株的van基因簇進(jìn)行了初步分析，在van基因簇中發(fā)現(xiàn)了一些插入及缺失變異（待發(fā)表結(jié)果），但這些變異是否會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)替考拉寧敏感性變化還有待證實(shí)。由于攜帶單一van基因VRE與攜帶vanA及vanM兩型van基因的VRE菌株相比，其耐藥表型無(wú)明顯差異，目前van基因檢測(cè)方法常不包括vanM基因，故當(dāng)前國(guó)內(nèi)外van基因分子流行病學(xué)研究可能漏檢vanM基因，低估vanM型VRE的危害。

總之，2016年上海地區(qū)臨床分離的VRE基因型仍僅有vanA和vanM 兩型，MLST分型顯示17株VRE分屬6種ST型，提示vanA和vanM 兩種耐藥基因可在不同屬腸球菌株之間進(jìn)行水平傳播。首次發(fā)現(xiàn)了同時(shí)攜帶vanA和vanM 2種高水平耐藥基因的VRE，攜帶2種耐藥基因的VRE檢出率高達(dá)29.4%（5/17），值得關(guān)注。

[1]胡付品， 朱德妹， 汪復(fù)， 等. 2015年 CHINET 細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J]. 中國(guó)感染與化療雜志， 2016，16（6）：685-694.

[2]胡付品， 朱德妹， 汪復(fù)， 等. 2014年CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J]. 中國(guó)感染與化療雜志， 2015，15（5）：401-410.

[3]GEE JE， DE BK， LEVETT PN， et al. Use of 16S rRNA gene sequencing for rapid confirmatory identification of Brucella isolates[J]. J Clin Microbiol， 2004，42（8）：3649-3654.

[4]Institute Clinical And Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing：27th informational supplement. CLSI document M100-S27[S].Clinical and Laboratory Standards Institute， Wayne， PA， 2017.

[5]林東昉， 陳春輝， 周迎， 等. 腸球菌萬(wàn)古霉素高水平耐藥基因vanA、vanB、vanD和vanM快速分型檢測(cè)[J]. 中華傳染病雜志， 2017，35（2）：99-104.

[6]LECLERCQ R， DERLOT E， DUVAL J， et al. Plasmidmediated resistance to vancomycin and teicoplanin in Enterococcus faecium[J]. N Engl J Med， 1988，319（3）：157-161.

[7]KRAMER A， SCHWEBKE I， KAMPF G. How long do nosocomial pathogens persist on inanimate surfaces? A systematic review[J]. BMC Infect Dis， 2006，6 ：130.

[8]SEE I， FREIFELD AG， MAGILL SS. Causative organisms and associated antimicrobial resistance in healthcare-associated，central line-associated bloodstream infections from oncology settings， 2009-2012[J]. Clin Infect Dis， 2016，62（10）：1203-1209.

[9]楊青， 俞云松， 林潔， 等. 2005－2014年CHINET腸球菌屬細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J]. 中國(guó)感染與化療雜志， 2016，16（2）：146-152.

[10]徐曉剛， 吳湜， 葉信予， 等. 新型腸球菌萬(wàn)古霉素耐藥基因簇——vanM基因簇[J]. 中國(guó)感染與化療雜志， 2009，9（6）：436-439.

[11]XU X， LIN D， YAN G， et al. vanM， a new glycopeptide resistance gene cluster found in Enterococcus faecium[J].Antimicrob Agents Chemother， 2010，54（11）：4643-4647.

[12]MARCADE G， MICOL JB， JACQUIER H， et al. Outbreak in a haematology unit involving an unusual strain of glycopeptideresistant Enterococcus faecium carrying both vanA and vanB genes[J]. J Antimicrob Chemother， 2014，69（2）：500-505.