云南松茸多糖提取方案優化及其測定*

魏曉梅，吳麗芳，柏旭，陶麗麗

（曲靖師范學院生物資源與食品工程學院，云南高原生物資源保護與利用研究中心，云南曲靖655011）

松茸（Tricholoma matsutake）又稱松口蘑、松蕈。屬擔子菌門（Basidiomycota）擔子菌綱（Basidiomycetes）傘菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae）口蘑屬（Tricholoma）[1]，是較為自然的類群[2]，也是我國二級瀕危保護物種[3]。松茸是樹木菌根菌，子實體一般單生，少數2個～4個叢生[4]，為名貴的野生食用菌之一，其富含粗蛋白、粗脂肪、粗纖維和多種維生素[5-6]，味道鮮美，且子實體提取物（多糖類物質）可提高身體免疫力[7]，具有抗癌抗腫瘤，治療糖尿病、心血管疾病，促進腸胃消化保護肝臟等功效[8]。有研究表明，松茸多糖能夠抑制一些組織的癌細胞生長，引起S期阻滯，上調p53 mRNA表達水平[9]。因此，松茸多糖的提取率對進一步研究及開發松茸相關產品具有重大意義。長期以來，雖然有許多研究者花費大量精力致力于研究松茸人工栽培[10-11]，并取得了大量成果[12-13]，但由于松茸屬于活體共生菌[3]，到目前為止，馴化栽培松茸子實體主要還是以半人工栽培（仿生態栽培）為主[14]。在國外一些國家，已有深受歡迎的具有增強免疫功效的常用保健食品松茸多糖膠囊和口服液[15]。

鑒于多糖的利用價值，有很多研究者采用不同的原理和方法提取不同材料中的多糖，水提醇沉法被廣泛應用于食用菌多糖的提取[16]。劉祖同、羅信昌歸納了食用菌子實體多糖水提醇沉法提取工藝步驟[1 7]，但不同的食用菌材料多糖提取的工藝不盡相同，且提取的效率也有很大差別[18-19]。本研究以楚雄州大姚縣和香格里拉云南松和櫟樹共生的山林中采集的松茸為原材料，結合前人研究的基礎進一步利用正交試驗設計中因素和水平的結合探索最佳松茸多糖提取方案，并通過同樣的提取方法對比分析不同采集地松茸粗多糖含量的差異，為松茸相關產品的進一步開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

松茸子實體于2016年分別采自楚雄州大姚縣和香格里拉市云南松與櫟樹共生的山林中。

正丁醇，天津市風船化學試劑科技有限公司生產，分析純；丙酮，天津市化學試劑三廠生產，分析純；三氯甲烷，南陽市科龍化工試劑廠生產，分析純；無水乙醇，天津市風船化學試劑科技有限公司生產，分析純。

高速組織搗碎機，上海標本模型廠制造，DS-1；電子天平CP114，奧豪斯儀器（上海）有限公司制造，精確度等級Ⅰ；離心機，大地自動化儀器廠制造，80-1離心機；數顯鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠制造，GZX-9070 MBE；DKS26電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司制造。

1.2 方法

根據前人的研究結果，選擇對提取結果可能較大影響的四因素三水平設計正交試驗，見表1。松茸新鮮子實體切片，烘干搗碎過篩備用。4 000 r min-1離心10 min，重復并合并上清液，沉淀再次按照正交表分別加入10倍、15倍、20倍蒸餾水，再次重復2次后合并上清液，Sevag（氯仿∶正丁醇=4∶1）法除蛋白質。重復3次后旋轉蒸發濃縮至原體積的1/3，待濃縮液冷卻后往濃縮液中分別加入無水乙醇，使濃縮液中乙醇濃度達到預先設計的量，4℃低溫靜置24 h醇沉，4 000 r min-1離心10 min，分離乙醇與沉淀；醇沉結束后往水層中加入乙醇，使乙醇的量達到75%進行沉淀，去除水層并用丙酮進行洗滌除水。將用丙酮進行除水后的沉淀物放到50℃的鼓風干燥箱內進行干燥（約5 h），待恒重后稱量即為粗多糖提取量。

表1 四因素三水平正交設計水平表Tab.1 Orthogonal design in scale with four factors and three levels

2 結果與分析

2.1 浸提過程分析

楚雄松茸、香格里拉松茸浸提液情況分別見圖1～圖3，浸提液除蛋白過程見圖4。

圖1 楚雄松茸第一次浸提液Fig.1 The first extracts of Tricholoma matsutake from Chuxiong

圖2 香格里拉松茸第一次浸提液Fig.2 The first extracts of Tricholoma matsutake from Xianggelila

圖3 楚雄松茸第二次浸提液Fig.3 The second extracts of Tricholoma matsutake from Chuxiong

圖4 浸提液除蛋白Fig.4 Deproteinization from the leaching liquid

研究過程中發現，不同生境松茸的浸提液顏色有明顯差異（圖1、圖2），說明2種松茸的色素含量不同。不同的浸提次數所得到的松茸浸提液顏色是不同的（圖1、圖3），浸提次數越多，浸提液顏色越淡。

Sevag法除蛋白操作時，試管溶液分成3層，其中上層為多糖溶液，下層為有機溶劑，中間為蛋白質（圖4），松茸子實體中蛋白質含量較高，這與前人的研究結果一致。

2.2 正交試驗提取松茸多糖結果分析

2.2.1 楚雄松茸正交試驗提取多糖結果分析

楚雄松茸多糖提取結果見表2。

表2 楚雄松茸正交試驗結果Tab.2 Orthogonal test results of Tricholoma matsutake from Chuxiong

表2分析發現，不同條件下多糖提取量有明顯的差異，試驗組合為A2B1C2D3時，每1克松茸其多糖提取量為0.1676 g；試驗組合為A3B2C1D3時，每1克松茸其多糖提取量為0.0732 g。K1、K2和K3為各因素在相同水平下多糖提取量的和；RⅠ為K1、K2和K3值的極差。分析RⅠ發現，在因素C（料液比）條件下RⅠ為0.1689，高于其他因素的RⅠ，說明此因素即料液比對試驗的影響最大，且隨著料液比的降低，松茸多糖提取量有較大的升高。因素A（浸提時間）RⅠ為0.1175，從K值可以看出浸提時間為3 h時，松茸多糖提取量是最高，因此最佳的浸提時間為3 h。因素B（浸提溫度）RⅠ為0.0947，對多糖提取量有一定的影響，從K值可以看出浸提溫度為80℃時，松茸多糖提取量最高。雖然因素D（乙醇濃度）RⅠ為0.0730，相對是最小的，但是從K值可以看出乙醇濃度對K值的大小也存在一定的影響。據此分析各因素對試驗結果的影響程度為C＞A＞B＞D，即料液比＞浸提時間＞浸提溫度＞乙醇濃度。

2.2.2 香格里拉松茸正交試驗提取多糖結果分析

香格里拉松茸多糖提取結果見表3。

表3 香格里拉松茸正交試驗結果Tab.3 Orthogonal test results of Tricholoma matsutake from Xianggelila

表3分析發現，不同條件下多糖提取量有著明顯的差異。試驗組合為A3B2C1D3時，多糖提取量最少，每1克松茸可得到多糖0.0592 g；試驗組合為A2B1C2D3時多糖提取量最高，每1克松茸可得到多糖0.1197 g。對比RⅡ值發現，各因素對試驗結果的影響程度為B＞C＞D＞A。由表3可知因素B（浸提溫度）RⅡ為0.0933，對試驗結果的影響最大，其次是因素C（料液比），其RⅡ為0.0708，從K值可以看出料液比1:20時，松茸多糖提取量最高；因素D（乙醇濃度）RⅡ為0.0591，從K值可以看出乙醇濃度90%。雖然因素D（浸提時間）RⅡ為0.0417，對試驗結果影響最小，但是從K值可以看出，乙醇濃度對K值的大小有一定的影響。

通過同樣的組合提取不同生源地的松茸子實體多糖，在A2B1C2D3條件下，兩地的野生松茸多糖提取量均最高，但楚雄野生松茸的多糖提取量大于香格里拉野生松茸的多糖提取量；在A3B2C1D3條件下，兩地的野生松茸多糖提取量均最低，但楚雄松茸的多糖提取量仍大于香格里拉松茸，其他組試驗也出現同樣的現象，因此，可推斷，不同生境條件下生長的松茸存在差異，在本研究中則表現為子實體中多糖含量的差異。楚雄松茸的多糖含量高于香格里拉松茸的多糖含量，且A2B1C2D3，即80℃浸提3 h，料液比1:15，95%乙醇沉淀，為最佳的松茸子實體多糖提取條件。

從浸提時間來看，楚雄松茸的K2＞K1＞K3，香格里拉松茸的K12＞K11＞K13，二者相同，所以對于兩地松茸來說太短或太長的浸提時間均不利于多糖的提取。

對于浸提溫度，楚雄松茸的K1＞K3＞K2，香格里拉松茸的K11＞K13＞K12，二者相同，所以對于兩地松茸來說太高或太低的浸提溫度均不利于多糖的提取。

比較料液比發現，楚雄松茸的K3＞K2＞K1，香格里拉松茸的K12＞K13＞K11，所以對于楚雄松茸來說料液比比值越小，多糖提取量越高。但是對于香格里拉松茸來說，太大或者太小的料液比都不利于多糖的提取。

醇沉時不同的乙醇濃度對結果也有影響，楚雄松茸的K3＞K1＞K2，香格里拉松茸的K12＞K13＞K11，由此看出楚雄松茸醇沉時對乙醇濃度不敏感。但是對于香格里拉松茸來說，太高或者太低的乙醇濃度均不利于多糖的提取。

在楚雄松茸多糖提取結果中，各因素對試驗結果的影響程度為C＞A＞B＞D；而在香格里拉松茸多糖提取結果中，各因素對試驗結果的影響程度為B＞C＞D＞A。料液比這個因素對于楚雄松茸的多糖提取量影響最大，但影響香格里拉松茸多糖提取量最大的因素是浸提時間。

3 討論

綜上所述，楚雄松茸與香格里拉松茸的最佳提取方案可以相同，但提取的多糖量有差異，本研究中選取的4個因素對兩地的松茸子實體多糖的提取量的影響基本保持一致。原因可能是松茸的所處生境存在差異。在不同生境條件下，松茸生長過程中代謝產物的量存在差異。雖然兩地“年溫差較小，日溫差較大”，但從日照強度來看，楚雄的日照強度、平均海拔均低于香格里拉；而且楚雄的年平均氣溫高于香格里拉；再者，楚雄受亞熱帶季風氣候影響，而香格里拉則屬于山地寒溫帶季風氣候，因此楚雄的雨季比香格里拉提前1個月。由于生理環境的差異，造成了兩地松茸多糖含量的差異，同時多糖種類方面也存在差異。

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