干巴菌物種復合群與云南松形成的外生菌根形態特征及分子鑒定*

魏杰，楊岳，李樹紅，張小雷，蘇開美**

（1.內蒙古農業大學林學院，內蒙古呼和浩特010018；2.云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所，云南昆明650223）

干巴菌（Thelephora ganbajun）屬于擔子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）非褶菌目（Aphyllophorales）革菌科（Thelephoraceae）革菌屬（Thelephora）的一類真菌[1]。革菌屬為世界廣布屬，Corner于1968年在其革菌屬世界性專著中共報道51種[1]。我國目前的報道中有16種，其中云南產11種[2]。

干巴菌子實體呈扇狀或蓮座狀瓣片，全菌干燥革質，在我國云南所指“干巴菌”一名，實際包括多種革菌類[3]。據報道，云南市場上的干巴菌主要有6種，即蓮座革菌（Thelephora vialis Schw.）、橙黃革菌（T.aurantiotincta Corner.）、日本革菌（T.japonicaYasuda）、淡褐革菌[T.fuscella(Ces.)Lloyd]、掌狀革菌[T.palmata(Scop.)Fr.]和干巴菌（T.ganbajunM.Zang）[2，4-5]。

干巴菌子實體與松科植物形成共生關系，多生于松林下。國外對革菌屬Thelephora真菌的外生菌根研究較多，其中以T.terrestrisEhrh.的研究最多[6-8]。我國對Thelephora屬真菌的外生菌根研究不多，目前為止僅對干巴菌的菌根做過初步研究。敬一兵[9-10]調查發現干巴菌的菌根顏色為灰白色至黑褐色，形狀是珊瑚狀至連續二叉式分枝狀，但沒有對干巴菌菌根的解剖結構進行研究。朱啟順和楊大智[11]不僅觀察了干巴菌菌根的外部形態結構，同時還對干巴菌的菌套特征進行了描述，但是，他們都沒有對該菌根進行分子鑒定。

Sha等[12]對中國西南地區干巴菌的遺傳多樣性進行了研究，結果表明，干巴菌可能是1個種的集群，包含了很多隱存種。干巴菌可與云南松（Pinus yunnanensisFranch.）、思茅松[P.kesiyaRoyle ex Gord.var.langbianensis(A.Chev.)Gaussen]和滇油杉（Keteleeria evelynianaMast.）具有非專一性密切的共生關系[2]。因此，干巴菌形成的菌根形態類型也可能有很多種，這就需要對干巴菌的外生菌根進行廣泛的研究。

本文根據Agerer的外生菌根描述，系統詳細描述了干巴菌與云南松形成的外生菌根的外部形態和內部解剖結構特征，并首次運用分子生物學方法進行了系統發育分析。

1 材料與方法

1.1 干巴菌子實體和菌根采集方法

1.1.1 子實體和菌根采集地點

本研究中干巴菌子實體（如圖1A所示）和菌根，采自云南省昆明市宜良縣狗街鎮小哨村云南松林中，干巴菌生長林地的土壤是紅壤，成林樹種是云南松，林下有少量杜鵑和野胡椒等。

1.1.2 子實體和菌根采樣

尋找到干巴菌子實體后拍照并記錄生境，用小刀切取一部分干巴菌子實體用于分子鑒定。為了保護干巴菌的菌塘，在子實體基部外圍1 cm～30 cm的土壤內，沿著云南松的根系尋找側根。小心找到干巴菌子實體基部根狀菌索，并順著根狀菌索用鑷子輕輕剝離土壤尋找外生菌根。用枝剪剪下帶有外生菌根的側根并用泥土包裹裝袋并進行編號，將子實體和外生菌根帶回實驗室。

1.1.3 子實體和菌根處理

將新鮮子實體放入冰箱內冷藏用于分子鑒定。把采集到的帶有側根的土壤用自來水浸泡20 min后，在OLYMPUS SZX16體式顯微鏡下用解剖針或者鑷子挑去粘在菌根上的泥土雜物，并用小刷子清洗。將洗干凈的側根放到干凈的盛水培養皿中在解剖鏡下觀察。

1.1.4 菌根形態觀察

用鑷子挑取菌根系統的1個未分支末端，放在滴有1滴水的載玻片上，在解剖鏡下用鑷子夾住未分支末端的根部，用鋒利的解剖針剝下菌套，壓片，在Nikon ECLPSE 80i顯微鏡下觀察并描述菌套特征，并用Nikon Y-Tv55照相。菌套描述按照Agerer的描述系統。剩余的菌根用FAA固定液和CTAB分別保存，用于以后的觀察和分子生物學鑒定[13-15]。

1.2 分子鑒定

干巴菌子實體和菌根的DNA提取，采用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（植物），生工生物工程（上海）有限公司。PCR擴增反應在Eppendorf Maseter cycler PCR儀上進行。50 μL的PCR擴增反應體系組成包括：25 μL 2×Power Taq PCR MasterMix（北京百泰克生物技術有限公司），引物ITS1F和ITS4各2 μL，DNA模板1 μL，加雙蒸水補足50 μL。擴增程序：94℃預變性5 min；94℃變性40 s，57℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環；72℃后延伸10 min。PCR產物的純化和測序交由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。序列的編輯采用bioedit完成。

將該干巴菌子實體和菌根的序列與GenBank數據庫中的序列進行比對（BLAST），將同源性最高的序列下載下來作為參考。并根據王鵬飛[16]的研究，將干巴菌模式標本序列和近似系統種序列都下載下來用于本研究的系統發育分析中。使用MEGA軟件（v7.0.14）進行Alignment，然后使用Phylogenetic Analysis中的Construct/Test Neighbor-Joining（NJ）鄰接法，將Bootstrap設為1 000次進行建樹，最后對所建系統發育樹進行調整并保存。

2 結果與分析

2.1 干巴菌外生菌根形態和解剖結構特征

干巴菌外生菌根形態和解剖結構特征見圖1。

2.1.1 形態特征

菌根系統二叉分支（0～5級），親水。未分支末端直，幼時黃色，老時棕褐色，長4 mm～7.6 mm，直徑3.5 mm～4.8 mm，表面光滑，有少量的外延菌絲，成稀疏的羊毛狀（如圖1B所示）。

圖1 干巴菌隱存種子實體及外生菌根的形態和解剖結構圖Fig.1 Fruitbody of cryptic species of Thelephoraganbajun,morphology and anatomy of ectomycorrhizae

2.1.2 解剖結構特征

菌套表面有菌絲網，由膨大的細胞連接形成（如圖1C所示），菌絲細胞直徑4 μm～8 μm。外層菌套為密絲組織，菌絲無色，直徑3 μm～8 μm，細胞壁薄，有些菌絲有鎖狀聯合（如圖1D所示）。中層菌套為密絲組織，菌絲無色，直徑3 μm～5.5 μm，有些菌絲有鎖狀聯合（如圖1E所示）。內層菌套也為密絲組織，菌絲無色，直徑3 μm～5.5 μm，有些菌絲有鎖狀聯合（如圖1F所示）。

外延菌絲無色，直徑4.5 μm～5.5 μm，細胞壁薄，菌絲表面光滑。分支多，分支處有鎖狀聯合（如圖1G所示）。菌絲有接合現象，接合處無隔或無鎖狀聯合，呈“H”型（如圖1H所示）。

2.2 干巴菌外生菌根分子鑒定結果

基于ITS片段構建的革菌系統發育樹見圖2。

由圖2可知，以Tomentella stuposa做外類群，用NJ法構建系統發育樹顯示，本研究中的干巴菌子實體及外生菌根序列與5個干巴菌子實體序列聚在一起，形成1個獨立的分支clade1，且bootstrap為100%。同時還有2個干巴菌序列EU696827和EU696946形成1個獨立分支clade2，bootstrap為87%。

圖2 基于ITS片段構建的革菌系統發育樹Fig.2 ITS phylogenetic tree of Thelephora

3 討論

在革菌屬中，至今描述最多的是T.terrestris的外生菌根，它的形態結構具有如下特征：菌根帶褐色的，親水；菌套屬于D型，即外層菌套為密絲組織且帶有錐狀的囊狀體；根狀菌索為thelephoroid，即根狀菌索的菌絲有輕微區別，外圍菌絲的直徑要小于中間菌絲；外延菌絲有鎖狀聯合，菌絲接合處為“H”型[17]。本研究中的菌根與T.terrestris菌根的共同之處在于：菌根呈褐色，親水；均具有密絲組織的菌套；外延菌絲有鎖狀聯合，且菌絲接合處無隔或無鎖狀聯合。但也存在不同之處：本研究中的菌根菌套表面由膨大的細胞連接形成菌絲網，無典型的錐狀囊狀體，且基部有鎖狀聯合的囊狀體是最大的不同之處。

本研究中菌根具有二叉分支，菌根呈黃褐色，外層、中層和內層菌套為密絲組織，菌絲有鎖狀聯合且有“H”型的菌絲細胞接合現象，與朱啟順和楊大智對T.ganbajun菌根的觀察結果相同[11]。但本研究中觀察到的菌套表層具有由膨大細胞形成的菌絲網，這在他們的研究中未提及。

系統發育樹顯示，該菌根序列與本研究采集的干巴菌子實體序列以及5個定名為干巴菌的序列在1個獨立分支clade1中，且bootstrap值非常高。但這5個序列都非源自干巴菌模式標本。雖然王鵬飛等[16]通過不懈的努力后獲得了干巴菌模式標本的ITS序列，但是在GeneBank中沒有找到該序列，因此本研究中并沒有加入干巴菌模式標本序列。但在他的研究中有2個序列，即EU696827和EU696946與模式標本的ITS序列形成1個獨立分支，這兩個序列在本研究中也形成一個獨立分支clade2。Sha等把未與干巴菌（Thelephora ganbajun）模式標本序列形成單系分支的干巴菌定義為干巴菌的隱存種[12，16]。因此，本研究中的菌根是由干巴菌隱存種與云南松形成的外生菌根。

Sha等[12，16]的研究還認為目前分布在云南地區（除普洱地區）被認為是干巴菌的真菌，很可能是Tomentella屬的1個或幾個新種[12]。目前的菌根研究結果表明，除Tomentella ferruginea和Tomentella brunneorufa具有密絲組織的外層菌套外，絕大多數已研究的Tomentella形成的菌根具有擬薄壁組織結構的外層菌套。謝雪丹和劉培貴[18]對云南松6個棉革菌外生菌根進行了形態和解剖結構觀察，所有6個Tomentella外生菌根的外層菌套均為擬薄壁組織。外層菌套結構不是唯一鑒定Thelephora和Tomentella的標準，隨著解剖結構特征結合分子生物學方法的發展，外生菌根的形態研究也許可以為Thelephora-Tomentella真菌的分類提供一些依據，并為發現“T.ganbajun”的隱存種提供線索。

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