多糖、粗蛋白含量高的灰樹花菌株篩選*

李蓉，張金鈺，陳麗，姚庭永，葉長文，吳應淼

（1.浙江省慶元縣食用菌科學技術研究中心，浙江省麗水食用菌技術創新服務平臺，浙江省食用菌工程技術研究中心，浙江麗水323000；2.慶元縣農業局，浙江慶元323800）

灰樹花，學名：Grifola frondosa，英文名：Maitake，屬擔子菌亞門（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes）多孔菌目（Polyporales）亞灰樹花菌科（Meripilaceae）樹花屬（Grifola）[1]。灰樹花是最有價值的食藥兩用菇類，特別是從灰樹花中提取的最有效成分灰樹花D-fraction，具有極強的抗癌功效[2]。有研究表明，從灰樹花深層發酵液和菌絲體中提取的多糖，與子實體中提取的多糖具有同樣的抑制腫瘤、提高肌體免疫功能的作用[3]。顧順明等[4]研究表明灰樹花子實體和菌絲體具有相同種類的氨基酸，且氨基酸含量比較接近。國內外對食用菌中活性物質的研究多集中于食用菌中蛋白質的抗病毒、抗腫瘤和多糖抗腫瘤以及作為癌癥輔助治療藥劑等方面[5]。陳寧等[6]從灰樹花中分離到具有抗TMV活性的蛋白質。

液體深層發酵具有培養周期短，成本低，產量高，易于實現工業化生產，能快速增殖菌絲體細胞，活性物質的有效成分易于控制，生產效率高等優勢。筆者對13種不同灰樹花菌株進行栽培、搖瓶發酵，通過比較不同菌株子實體、菌絲體間胞內多糖和粗蛋白含量，篩選出胞內多糖、粗蛋白含量高，而且分別適宜栽培以及液體發酵的灰樹花菌株，以期滿足灰樹花栽培與加工的不同需求，提供特定優良的菌株。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養基

試驗采用本單位從國內外收集的13個灰樹花菌株（Grifola frondosa），編號和來源分別為G1：美國賓夕法尼亞州大學，G4：福建三明真菌研究所，G5：日本，G6：河北，G7、G8、G9、G10：上海農科院食用菌研究所，G13：四川，G20：山東泰安，慶灰151、慶灰152、小黑汀：浙江省慶元縣食用菌科學技術研究中心。

培養基配方：木屑34%、棉籽殼34%、麥麩10%、玉米粉10%、曬干山表土10%、石膏1%、紅糖1%，含水量55%～60%，pH自然。

斜面培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖2 g、蛋白胨2 g，水1 000 mL。

發酵培養基：玉米粒浸出物1 000 g、葡萄糖2 g、蛋白胨0.3 g、KH2PO40.3 g、MgSO4·7H2O 0.05 g，水1 000 mL。

1.2 主要試劑與儀器設備

苯酚：藥檢專用，國藥集團化學試劑有限公司；濃硫酸：分析純，浙江中星化工試劑有限公司；加速劑（3.5 gK2SO4和0.4 gCuSO4·5H2O）：福斯分析儀器（蘇州）有限公司；氫氧化鈉：分析純，西隴化工股份有限公司；無水乙醇：分析純，安徽安特食品股份有限公司；硼酸：分析純，太倉美達試劑有限公司。

MJ33水分快速測定儀，梅特勒托利多；Direct-Q超純水系統，密理博；FW135固體樣品粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司；GZX-9240MBE熱風內循環烘箱，上海博訊實業有限公司；PL403電子天平，梅特勒托利多；SKY-211B全溫搖床，上海蘇坤實業有限公司；Thermo移液器，美國熱電；MLS-3780高壓滅菌鍋，日本三洋；DKL12消解儀，意大利VELP；UDK139凱氏定氮儀，意大利VELP；Lambda25紫外分光光度計，鉑金埃爾默。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同菌株人工栽培產量的比較

按培養料配方要求稱量后，先將紅糖溶于水，然后用紅糖水拌勻玉米粉、麥麩、山表土、石膏，下一步拌入木屑，最后拌入經預濕的棉籽殼，裝入規格為15 cm×55 cm×0.04 cm聚乙烯筒袋。將料袋打一直徑1.0 cm～1.5 cm的小孔，料溫達100℃狀態下保持16 h滅菌。滅菌徹底后冷卻接種，接種時無菌操作。經人工栽培統計2茬菇（菌棒1茬菇和覆土2茬菇）產量，計算單產和生物轉化率。

1.3.2 不同菌株液體發酵菌絲生物量的比較

水稻產量形成是一個復雜的系統過程，影響其產量的各個性狀之間具有復雜的關聯性[5]。因此，無論在育種工作中還是生產實際中都要綜合考慮各項性狀指標[6-7]。通過黔糯優11產量及主要性狀的相關分析與通徑分析，明確了產量構成要素之間的關系，在合理群體有效穗的同時，提高穗粒數和結實率是確保黔糯優11增產的關鍵措施。

發酵條件：25℃，搖床轉速150 r·min-1，種子培養基接種量為直徑6 mm圓餅5個，裝液量為250 mL三角瓶裝100 mL發酵液，初始pH為6.0，發酵周期為11 d，液體發酵培養基接種量為100 ml·L-1，發酵周期為5 d。

發酵結束后，將三角瓶中的菌絲體經60目篩過濾后，用蒸餾水沖洗干凈，然后置于35℃烘箱中烘3 h后，調節烘箱溫度至50℃烘干，用電子天平稱量菌絲體干重，取5瓶菌絲體干重的平均值，以mg/100mL計。

1.3.3 不同菌株子實體、菌絲體胞內多糖含量測定

先將烘干的子實體進行粉碎，然后所有待測子實體在50℃下烘干24 h。將烘干的子實體、菌絲體置80℃水浴中恒溫浸提2 h，共3次，過濾，棄殘渣，取濾液，菌絲經超聲波破碎30 min，加水煮沸浸提3 h（第1次提取2 h，第2次提取1 h），加水量90 mL（第1次提取60 mL，第2次提取30 mL），過濾，棄殘渣，取濾液，上清液濃縮至10 mL，將上述濃縮液經無水乙醇洗滌后所得溶液為胞內多糖測試液。

取1 mL上述多糖溶液，加入苯酚1 mL，然后迅速加入5 mL濃硫酸搖勻，30℃水浴中顯色20 min，反應生成橙黃色溶液，反應產物在490 nm處比色，采用外標法分析胞內多糖含量。

標準曲線制作：配制100 ml·L-1的葡萄糖標準溶液，吸取0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的標準溶液至10 mL試管中，用蒸餾水補至1.0 mL。向試管中加入1.0 mL5%苯酚溶液，然后迅速加入5.0 mL濃硫酸搖勻，30℃水浴中顯色20 min，另以雙蒸水代替多糖溶液同上操作，為空白對照，在490 nm波長處測定吸光度值。以多糖濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.4 不同菌株子實體、菌絲體粗蛋白含量的測定

按GB/T15673-2009食用菌中粗蛋白含量測定中的規定方法，取1 g灰樹花粉放入消煮管，再加入濃硫酸10 mL，加速劑1片，之后進行梯度消解，150℃下消解30 min，260℃下消解60 min，420℃下消解120 min。

將帶消化液的消煮管插在蒸餾裝置上，以25 mL硼酸溶液為吸收液，加入2滴甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑，蒸餾裝置的冷凝管末端浸入裝有吸收液的250 mL錐形瓶內，然后向消煮管中加入40 mL氫氧化鈉溶液進行蒸餾。使蒸餾液猛烈沸騰，釋放出的氨被吸收液吸收，待吸收液變綠色之后繼續蒸餾5 min，吸收液達100 mL左右時停止蒸餾。取下錐形瓶，使冷凝管末端離開液面，繼續蒸餾1 min～2 min，并用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗滌液均需流入錐形瓶內，然后停止蒸餾。

立即用0.1 mol·L-1鹽酸標準溶液進行滴定，吸收液由藍綠色滴定至灰紅色。30 s保持不變即為終點。

試樣中粗蛋白含量以質量分數計，數值以克每百克（%）表示，計算結果保留到小數點后1位。

式中：c表示鹽酸標準溶液的濃度，單位為mol·L-1；V0表示空白試液滴定消耗的鹽酸標準溶液體積，單位為mL；V1表示試料滴定消耗的鹽酸標準溶液體積，單位為mL；m表示試料的質量，單位為g；0.014表示氮的摩爾質量，單位為g·mmoL-1；w表示試料含水率，單位為%；6.25表示氮換算成粗蛋白質的系數。

2 結果與分析

2.1 不同菌株人工栽培產量

13個灰樹花菌株，每個菌株栽培90棒（分3個小區），觀察子實體顏色，計算平均每棒單產和生物轉化率，結果見表1。

由表1結果可以看出，灰樹花子實體顏色有白、白灰、灰等顏色。慶灰151、慶灰152、G7菌株平均單產較高，生物轉化率較高；G13菌株平均單產最低，其余均相差不大。生物轉化率同平均單產成正比。

表1 試驗菌株出菇性狀Tab.1 Fruiting characteristics of test strains

2.2 不同菌株液體發酵菌絲生物量的比較

不同試驗灰樹花菌株的菌絲生物量測定情況見表2。

表2結果表明，G6菌株發酵培養液中菌絲生物量最大，達到725.1 mg/100mL，其次為G13、G20、G5、140、慶灰152、G9、G8、慶灰151菌株，菌絲生物量介于352.9 mg/100mL～208.0 mg/100mL，菌株G7、G10、G4、G1、小黑汀菌絲生物量均低于200 mg/100mL。發酵液顏色呈淡黃或棕黃色，菌絲球呈小米粒狀或較小米粒稍大，發酵產物pH呈酸性，發酵液具有灰樹花味。

表2 試驗菌株菌絲生物量測定Tab.2 Mycelial biomass of test strains

2.3 不同菌株子實體、菌絲體胞內多糖含量的測定

不同灰樹花菌株子實體、菌絲體胞內多糖含量的測定結果見圖1。

圖1 不同灰樹花菌株子實體、菌絲體胞內多糖含量Fig.1 Intracellular polysaccharide content from fruiting body and mycelium of different Grifola frondosa strains

子實體胞內多糖含量測定結果表明，G5、G6、G1、G4、G13菌株子實體中胞內多糖含量較高，其中G5菌株最高達到17.89%，而慶灰151、慶灰152、小黑汀等栽培應用品種中子實體胞內多糖含量偏低。

菌絲體胞內多糖含量測定結果表明，G6菌株胞內多糖含量較高達到11.49%，其次為G1、G20菌株，而慶灰151、慶灰152、小黑汀等栽培應用品種中菌絲體胞內多糖含量較低。

分析認為，生產主栽灰樹花品種經過多年栽培應用，可能菌株有所退化，導致胞內多糖含量有所下降。因此，選育出多糖含量高的灰樹花新菌株，將是灰樹花育種需考慮的目標方向之一。

2.4 不同菌株子實體、菌絲體粗蛋白含量的測定

不同菌株子實體、菌絲體粗蛋白含量的測定結果見圖2。

子實體粗蛋白含量測定結果表明，除G13、慶灰151菌株子實體粗蛋白含量低于7.35%外，其余灰樹花菌株子實體中粗蛋白含量均較高，G7菌株粗蛋白含量最高達到32.24%。菌絲體中粗蛋白含量測定結果表明，G6菌株菌絲體中粗蛋白含量最高達到21.44%，G20、G13菌株中粗蛋白含量稍高，其余的均相差不大。

圖2 不同菌株子實體、菌絲體粗蛋白含量Fig.2 Crude protein content from fruiting body and mycelium of different strains

3 小結

參試的13個灰樹花菌株中，G5菌株為胞內多糖含量高，并且適宜子實體栽培應用的灰樹花菌株；G6菌株為胞內多糖含量高，并且適宜液體發酵培養菌絲體的灰樹花菌株；G7菌株為粗蛋白含量高，并且適宜子實體栽培應用的灰樹花菌株；G6菌株為粗蛋白含量高，并且適宜液體發酵培養菌絲體的灰樹花菌株。

在今后的灰樹花育種工作中，可將多糖、粗蛋白含量作為品種品質的衡量指標，以期為深加工領域研發高附加值產品提供優良菌株。

[1]楊楊，郭健，李長田.基于核糖體基因的灰樹花分子系統關系分析[J].中國食用菌，2016，35（6）：42-45.

[2]甘長飛.灰樹花的保健功效研究文獻綜述[C]//首屆中國食用菌養生研討會論文集.慶元：中國食用菌協會，2013：93-101.

[3]卜慶梅，倪艷波，黃清榮，等.灰樹花液體發酵培養基的篩選試驗[J].江蘇農業科學，2003（6）：103-105.

[4]顧順明，孫曄，王潞江，等.發酵法生產灰樹花菌絲體的研究[J].工業微生物，2003，33（4）：1-4.

[5]孫正祥，王瑞霞.食用菌中生物活性蛋白的研究進展[J].食用菌學報，2009，19（2）：85-90.

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