紅河州HIV/HCV合并感染者HCV基因亞型多樣性及種系進(jìn)化研究

楊蘭輝 陳梅 霍松 馬興麗 李瓊芬

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染是全球?qū)е侣愿窝住⒏斡不透渭?xì)胞肝癌發(fā)病的一個(gè)主要致病因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，HCV病毒感染致肝硬化和肝細(xì)胞肝癌的比例分別為27%和25%［1］。由于依賴RNA的RNA聚合酶復(fù)制具有高錯(cuò)誤率的特點(diǎn)，HCV病毒變異頻繁。因此，至今為止尚未研發(fā)出有效的預(yù)防性疫苗［2］。一方面HCV自身突變率高，另一方面機(jī)體感染HCV后，在宿主免疫系統(tǒng)免疫防御反應(yīng)以及抗病毒藥物篩選的雙重壓力作用下，目前已驅(qū)使HCV進(jìn)化成為7個(gè)不同基因型和超過67個(gè)亞型［3］。基因型1～3型呈全球范圍內(nèi)分布［4］。HCV 1a和1b亞型是流行于美國、歐洲、日本和中國中部地區(qū)最常見的基因亞型。2a和2b亞型約占全球HCV亞型的10%～30%，主要流行于北美、歐洲和日本地區(qū)，2c亞型發(fā)現(xiàn)于意大利北部［5?9］。基因型3型普遍流行于南亞一些國家和中國的南方地區(qū)。不同國家分布的基因亞型也不盡相同［8?9］。HCV 3a亞型還主要流行于歐洲和美國的靜脈吸毒人群（intravenous drug users，IDUs）中［10］。基因型4分布于北非和地中海東部的一些國家［4，11］。基因型5在南非地區(qū)普遍流行［12］。基因型6主要流行于東南亞的一些國家和中國的西南部［8，13］。一般而言，HCV基因型6在各基因型中表現(xiàn)出更高的多樣性。到目前為止，基因型6包含24個(gè)（6a～6xa）已知亞型和一些暫未命名的新變種亞型。基因型7在剛果的一名移民中首次報(bào)道［14］。就中國范圍內(nèi)而言，1b和2a亞型主要分布在中國的中部地區(qū)。1b主要在中國的南方流行，而2a主要在中國的北方流行［6，15］。 然而在中國的西南地區(qū)，基因型3和6型是最常見的基因型［16?17］。此外，越接近南亞國家的省份地區(qū)，6a亞型的流行率越高［11，16，18］。

HCV表現(xiàn)出非常高的遺傳多樣性，這種多樣性可對臨床產(chǎn)生不同的影響和結(jié)局。雖然不同的亞型并未在病毒的毒力和致病力方面顯示出明顯的差異性，但是不同基因型可引起病毒對干擾素和利巴韋林聯(lián)合治療的反應(yīng)性不同。明確HCV基因型對丙型肝炎患者選取合理的治療方案是十分必要的［19］。紅河州位于中國偏遠(yuǎn)的西南地區(qū)，和越南接壤，有許多少數(shù)民族在紅河世居。由于靠近毒品的集散地“金三角”，該地區(qū)靜脈吸毒率較高，因此丙型肝炎和艾滋病的發(fā)病率在全國范圍內(nèi)也相對較高。本研究旨在通過擴(kuò)增HCV的C/E1和NS5B 2個(gè)外顯子，運(yùn)用測序分析和遺傳進(jìn)化分析，明確紅河州地區(qū)HIV/HCV合并感染者HCV病毒基因型和亞型的流行及遺傳進(jìn)化情況。一方面為本地區(qū)該類患者合理的抗病毒治療提供科學(xué)依據(jù)，另一方面，同時(shí)監(jiān)測該類患者體內(nèi)的HCV是否存在遺傳進(jìn)化的新變異。

1 材料和方法

1.1 研究對象

研究對象為2014年1月至2014年11月到紅河州第一人民醫(yī)院就診的55名HCV?RNA檢測呈陽性的HIV/HCV合并感染的患者。診斷標(biāo)準(zhǔn)為丙型病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS 213?2008）［20］。其中男性39名，年齡范圍 30～51歲，年齡（39.4±5.1）歲；女性16名，年齡范圍29～48歲，年齡（39.2±5.4）歲。其中IDU感染42例，異性感染12例以及感染途徑不詳1例。

1.2 核酸提取及逆轉(zhuǎn)錄

患者血樣離心后取200 μL血清，按照操作指南指示在天隆核酸自動(dòng)提取儀（西安天隆科技有限公司DP968）上完成病毒核酸的提取。其中取20 μL核酸模板應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測樣品HCV?RNA載量，病毒載量＞1×103的樣本入選本組研究。取5 μL入選樣本RNA模板應(yīng)用Omega M?MLV First Strand Kit（Omega，美國），逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。體系為：random 6 mers（50 μmol/L）1 μL，dNTP mix（10 mmol/L）1 μL，加 Nuclease?Free Wa?ter至 18 μL，之后 70℃溫浴 5 min，置于冰上 2 min，再往體系中加入5× RT Buffer 5 μL，M?MLV Reverase Transcriptase 1 μL，RNase Inhibitor（40 U/μL）1 μL，輕輕混勻，37℃溫浴 60 min完成逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA放于-20℃冰箱凍存以備后用。

1.3 PCR擴(kuò)增

采用巢式PCR擴(kuò)增2個(gè)外顯子位點(diǎn)Core/E1（C/E1）和NS5B。參照文獻(xiàn)［21］合成4對引物（引物序列見表1）。C/E1內(nèi)套擴(kuò)增片段為468 bp；NS5B內(nèi)套為388 bp。PCR反應(yīng)體系總體積50 μL：10×PCR buffer 5 μL，dNTPs（各 2.5 mmol/L）4 μL，Ta?KaRa Ex Taq 0.25 μL（5 U/μL），1 U TaKaRa Ex Taq HS DNA Polymerase，上下游引物各 1 μL，cD?NA 1 μL，加水至50 μL。擴(kuò)增程序分別為：95℃預(yù)變性 10 min；95℃變性 1 min，48℃（C/E1）/50℃（NS5B）退火1 min，72℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min完成擴(kuò)增反應(yīng)。每次擴(kuò)增均帶入陰性和陽性對照。PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)溴乙錠染色后用紫外成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。

表1 C/E1和NS5B的引物序列Table 1 Primers of C/E1 and NS5B

1.4 DNA測序和種系進(jìn)化分析

對經(jīng)電泳鑒定顯示有目的片段的產(chǎn)物進(jìn)行雙向測序分析（上海英駿生物技術(shù)有限公司）。測序結(jié)果與丙型肝炎數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)（http：//hcv.lanl.gov/content/sequence/BASIC_BLAST/basic_blast.html）進(jìn)行比對，初步確定樣品HCV感染亞型并應(yīng)用MEGA6進(jìn)行樣本種系進(jìn)化分析，并與HCV數(shù)據(jù)庫中各亞型參考序列比對，使用Neighbor?Joining 方法 Kimura 2?parameter模型構(gòu)建種系進(jìn)化樹，確定基因分型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。Pearsonχ2檢驗(yàn)或確切概率法用于確定在不同分組中HCV基因型和亞型分布比例之間的差異性分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCV基因擴(kuò)增

2個(gè)擴(kuò)增位點(diǎn)分別為C/E1和NS5B。55例HCV樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，NS5B擴(kuò)增成功率是92.7%，C/E1擴(kuò)增成功率為94.5%。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳成像結(jié)果見圖1A和圖1B。擴(kuò)增產(chǎn)物基因測序曲線圖見圖2A和圖2B。

圖1 代表樣品擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Figure 1 AGE results of amplification products

2.2 紅河州地區(qū)HIV/HCV合并感染者HCV基因型及亞型多樣性的分布情況

將擴(kuò)增成功的NS5B和C/E1產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，初步判斷樣品HCV基因型及亞型的結(jié)果。綜合2個(gè)外顯子區(qū)域的比對結(jié)果，紅河州地區(qū)HIV/HCV合并感染者的HCV基因型及亞型分布情況見表2。

圖2 代表樣品擴(kuò)增產(chǎn)物測序圖Figure 2 Sequencing results of amplification products

表2 紅河州HIV/HCV合并感染者HCV基因型和亞型的流行情況［n（%）］Table 2 HCV genotypes and subtypes distribution of patient with HIV/HCV co?infection in Honghe［n（%）］

如表2所示，在不同的感染途徑組內(nèi)，均發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因型（1、3和6型）和5個(gè)亞型（1b、3a、3b、6a和6n）。IDU組和異性感染組之間各亞型的分布比例略有不同，可以看到6a、6n在IDU組的分布比例高于異性感染組，但是也許由于異性感染組病例相對較少的原因，HCV不同基因亞型的分布比例在不同感染組間比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.3 NS5B和C/E1的種系進(jìn)化分析

基于NS5B和C/E1的種系進(jìn)化分析，如圖3和圖4所示，紅河州地區(qū)HIV/HCV合并感染患者中流行的HCV基因型和亞型分布是大致吻合的，主要流行3個(gè)基因型（3、6和1型）和5個(gè)亞型（3b、6n、3a、6a和1b）。當(dāng)然也有部分不吻合的情況，首先在NS5B種系進(jìn)化樹圖（圖3）中，18號樣品（CC18）為3b亞型；而在C/E1種系進(jìn)化樹圖（圖4）中，它們卻與6a亞型叢集在一起，且展支持率和核苷酸相似度均較高（圖3、圖4，標(biāo)注▲）。其次，對于只有單個(gè)外顯子擴(kuò)增成功的樣本而言，如圖3所示，依據(jù)高的展支持率和高的核苷酸相似度，樣品11、22和24號（CC11、CC22和CC24）分別認(rèn)定為3a、3b和3b亞型（標(biāo)注●）；如圖4所示，依據(jù)高的展支持率和高的核苷酸相似度，樣品 5、15、26、50號（CC5、CC15、CC26和 CC50）分別認(rèn)定為 6a、3b、1b 和 3a亞型（標(biāo)注●）。除上述樣品外，圖3和圖4中其余樣本所示的HCV基因型和亞型的結(jié)果均吻合。

3 討論

HCV的遺傳多樣性并不是均勻地分布于病毒的整個(gè)基因組中。5′非編碼區(qū)（5′non?coding re?gion，5′NCR）是HCV小的非編碼區(qū)域，是HCV病毒最保守的區(qū)域，不同毒株中具有90%的序列同源性［23］。在源于5′NCR的種系進(jìn)化樹圖中，基因型1和6型的亞型會(huì)叢集在一起，因此它不能將基因型 1 和 6 型的亞型準(zhǔn)確區(qū)分出來［24?25］。由于RNA依賴的RNA聚合酶（NS5B）錯(cuò)配率較高，因此丙肝病毒具有廣泛的基因組變異性。另一個(gè)表現(xiàn)出重要的遺傳變異性的區(qū)域是編碼膜糖蛋白E1和E2的區(qū)域［26］。這3個(gè)區(qū)域常用于HCV基因型和亞型的分型［21?22，27］。由于 5′NCR 存在上述局限性，在本研究中，課題組選擇NS5B和C/E1區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，測序分析和種系進(jìn)化分析。

圖3 基于NS5B種系進(jìn)化樹圖HCV基因型和亞型的分布情況Figure 3 HCV genotypes and subtypes distribution based on phylogenetic trees of NS5B

圖4 基于C/E1種系進(jìn)化樹圖HCV基因型和亞型的分布情況Figure 4 HCV genotypes and subtypes distribution based on phylogenetic trees of C/E1

紅河州是云南邊疆的一個(gè)民族自治州，主要聚居的民族有哈尼族、彝族、回族、苗族和壯族等。紅河州包含13個(gè)縣市，其中3個(gè)縣市與越南接壤。由于靜脈吸毒人群較多以及HCV與HIV具有相同的傳播途徑，該地區(qū)HCV和HIV的流行率都較高。Dunford等［22］學(xué)者報(bào)道在越南HCV病毒流行的亞型主要是1a（42%），其次是1 b（28%），6a（22.5%）以及基因型6的其它亞型（5.5%）。本研究顯示，盡管與越南接壤，紅河州地區(qū)HCV流行的基因型和亞型的總體分布和越南是不同的。紅河州地區(qū)HIV/HCV合并感染患者中，HCV主要流行3個(gè)基因型（3型、6型和1型）和5個(gè)亞型（3b、3a、6a、6n和1b）。HCV 6a亞型在越南是普遍流行的亞型之一。Dunford 等［22］報(bào)道，6a在越南IDUs中的流行率是22.5%，而Pham等［27］報(bào)道，6a在越南獻(xiàn)血者中的流行率為37.1%。課題組進(jìn)一步關(guān)注到，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，云南省地區(qū)HCV 6a亞型近十年來呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢［13，17］。本研究數(shù)據(jù)顯示在紅河州的HIV/HCV合并感染患者中，HCV 6a亞型在IDUs中的流行率（19.0%）高于云南省平均水平（15%），而低于越南水平（22.5%）［22］。另一方面，Dunford等［22］報(bào)道6a在越南性工作者中的流行率為24.2%；而在本研究中，在紅河州地區(qū)通過性接觸感染的HCV患者中，6a亞型的流行率是8.3%（表2）。因此，課題組對紅河州地區(qū)的HCV 6a亞型的來源及進(jìn)化很感興趣，進(jìn)一步做種系分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，如圖3、圖4所示，紅河州地區(qū)分離的HCV 6a亞型分別與來自越南的參考序HPA399.AB523333和VN571.D88476叢集在一起，而且具有高的展支持率和核苷酸相似度；并且包括2008年Xia等［17］報(bào)道的分離于紅河州地區(qū)的3株HCV 6a亞型毒株（6a.CN.HH064.EU119980；6a.CN.HH081.EU119982；6a.CN.HH093.EU119981）均與越南株（6a.VN.VN571.D88476）叢集（圖4）。提示越南和紅河州地區(qū)分離的HCV6a亞型具有進(jìn)化關(guān)系。這些數(shù)據(jù)均提示，基于HCV 6a亞型在越南的高流行率，紅河州可能作為一個(gè)傳入點(diǎn)，HCV 6a亞型主要通過IDU的傳播方式，由越南傳入紅河州流行，進(jìn)而再傳入昆明或中國的其它地區(qū)流行。

本研究數(shù)據(jù)顯示，紅河州HIV/HCV合并感染者中HCV基因型和亞型的流行情況與Lu等［28］和李崢等［29］報(bào)道的云南昆明HCV的流行情況略有不同。Lu等［28］于2005年報(bào)道，3b（33.3%）是昆明HCV流行的最主要的基因亞型，其次是1b（20.0%）、2a（20.0%）和3a亞型（6.7%）。2006年李崢等［29］研究報(bào)道顯示46例樣本中，HCV 1b亞型（34.78%）仍是最常見的亞型，緊隨其后的是3b（21.74%）、基因型2型（17.39%，包括2a和2b）、3a（10.88%）和1a/2b的雙重感染（6.52%）。上述2項(xiàng)研究數(shù)據(jù)相比，發(fā)現(xiàn)HCV 1b亞型流行比例明顯上升。之后，Xia等［17］另一項(xiàng)研究數(shù)據(jù)顯示，在云南昆明主要流行3個(gè)基因型（1型、3型和6型）HCV。這一結(jié)論和本研究結(jié)果類似，基因型3型最常見，其次是6型和1型。和先前的研究數(shù)據(jù)相比，云南省HCV基因型6型的流行率增高了，尤其是6a和6n亞型。相比之下，基因型1和2型（包括亞型1b、1a、2a和2b）的流行率大幅下降。這個(gè)結(jié)論也與Zhang等［13］的研究報(bào)道數(shù)據(jù)相吻合。此外，樣品18號（CC18）在NS5B種系進(jìn)化樹圖中為3b亞型；而在C/E1種系進(jìn)化樹圖中，它卻與6a亞型叢集在一起，且展支持率和核苷酸相似度均較高（圖3、圖4，標(biāo)注▲），預(yù)示該份樣品可能存在雙重感染和/或重組［27，30］。

綜上所述，HCV 6a亞型是一個(gè)在越南和紅河州地區(qū)靜脈吸毒人群中具有高流行率的病毒亞型。一方面，基于近些年來，包含紅河州在內(nèi)的云南省HCV 6a亞型病毒的流行率逐年增高（從2008年5%逐漸上升至 2013 年的 15%）［13，17］；另一方面，基于NS5B和C/E1的種系進(jìn)化分析，紅河州地區(qū)分離的HCV 6a亞型毒株與來自越南的6a亞型的參考毒株叢集（圖4），這些數(shù)據(jù)提示，紅河州可能是HCV 6a亞型病毒由越南傳入中國的一個(gè)傳入點(diǎn)，HCV 6a亞型主要通過IDU的傳播方式，由越南傳入紅河州流行，進(jìn)而再傳入昆明或中國的其它地區(qū)流行。

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