人類微生物組學與健康及其臨床檢驗的需求

王慶忠 范云 沈祁燁

微生物與人類共生了數百萬年，在基因構成和代謝功能上與宿主形成“超生物體（Superorgan?ism）”，微生物種屬構成、相互作用、遺傳進化與人類的健康和疾病密切相關。傳統研究方法依賴于菌株分離與純培養，通過表型和生化特性鑒定，研究的微生物不到1%，不能在深度和廣度上發掘余下眾多微生物群系的系統發育及群落功能。近20年來高通量測序、生物信息學等現代生物學技術和大數據處理技術的發展，逐漸建立了以16S rDNA系統分析為基礎，宏基因組為發展方向的整體微生物組學研究方法。本文通過介紹微生物組學概念及其與疾病的關系和研究技術，探討微生物組學臨床應用和對診斷的需求，便于加深對這一新興學科的認識，有利于該技術在臨床更好地應用。

1 人類微生物組學概念及與健康的關系

1.1 人類微生物組學概念

人體皮膚、呼吸道、消化道、生殖系統等部位共生的微生物群落數量龐大，涵括病毒、古菌、細菌和真菌等微生物類型，成人體表和體內的微生物細胞估計是人類自身細胞的10倍，占體重的1%～2%［1?2］。為了解析人類健康和疾病與微生物群系的關系，研究者提出人類微生物組（human microbi?ome）或者“宏基因組（megagenome）”的概念。人類微生物組是人出生以后才進入人體與人類共生的位于身體不同部位的完整的人類微生物菌群基因組信息的總和［3］。宏基因組（metagenome）和宏轉錄組（metatranscriptome）指全基因組和RNA來源的特定的微生物基因轉錄本的總和。病毒組（virome）主要是指所有病毒的基因組，真菌組（mycobiome）主要是指所有真菌的基因組。

21世紀初，2個宏大的國際人類微生物組項目，由歐洲主導的人體腸道宏基因組學（metagenomics of human intestinal tract，MetaHit）和由美國主導的人類微生物組計劃（human microbiome project，HMP）開始聚焦人體中的微生物群系。2016年5月，美國白宮科學和技術政策辦公室宣布啟動“國家微生物組計劃（national microbiome initiative，NMI）”。經過十余年的研究，2個計劃發布初步研究成果。MetaHit分析了來自健康人、超重和肥胖的成年人以及腸炎病患者124種腸道細菌的330萬條非冗余基因，據估計，在人類腸道微生物存在超過1 000種細菌［4?5］。HMP初步分析178個與人類宿主有關的細菌基因組序列［6?7］。

1.2 微生物組與人類健康的關系

人體同微生物群體之間是共生與互惠關系。宿主為微生物提供保護和豐富的營養，微生物則為宿主提供消化、免疫和神經系統發育等支持和協作。研究表明，微生物與諸多重大人類疾病息息相關，如肥胖癥、糖尿病、自閉癥、抑郁癥、過敏癥、炎癥性腸道疾病、心血管疾病、多種癌癥等代謝、精神、免疫類疾病。

研究較為全面的是人類的腸道菌群與宿主之間的相互作用。腸道微生物與人類肥胖、營養物質（如糖類、短鏈脂肪酸）的吸收、重要維生素（維生素K、維生素B12）的產生、潛在致癌物質的脫毒等高度相關。腸道微生物基因組的測序工作揭示，微生物影響腸道血管生成和運動，減少腸道屏障的通透性，提高腸道免疫能力［8］。腸道微生物群系的定植和種群構成影響因素眾多。首先是出生時分娩方式，其次是早期的生活飲食類型，隨著年齡的增長，個人微生物群系逐漸穩定［9］。成年人腸道菌群的組成一般以嚴格厭氧菌為主，厚壁菌和擬桿菌類最為豐富，其次是變形桿菌、放線菌［10］。每個個體腸道微生物群系具有一定的獨特性，只有不到30%微生物為個體之間所共享［11］。華大基因研究院、歐洲分子生物學實驗室和深圳大學醫學院等單位完成的“腸道微生物與Ⅱ型糖尿病的宏基因組關聯分析”，識別了約6萬個Ⅱ型糖尿病候選生物標記物，并成功應用于糖尿病的臨床評定和病人診斷［4］。

神經退行性疾病與腸道微生物組的關系密切。淀粉樣蛋白與神經退行性疾病，特別是阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）密切相關。人體微生物產生的淀粉樣蛋白與AD、異常行為、自閉癥等神經退行性疾病的發病率存在一定關聯［12?13］。細菌淀粉樣蛋白可以激活TLR2、NFκB、TLR1、CD14等炎癥分子［14］。TLR2導致notch1上調，notch1在AD的發展中起著關鍵的作用［15］。在胃部，健康人的胃是以普氏菌、鏈球菌、韋榮球菌、羅思氏菌和嗜血桿菌為主［16］。幽門螺桿菌是慢性胃炎患者的主導菌群，該菌在腸道菌群和其他物種之間的相互作用可能會導致胃癌高發；數量眾多的鏈球菌屬與胃竇炎有關［17］。胃癌患者和健康人群之間胃部菌群的大類差異不顯著，差異主要體現在鏈球菌、乳酸桿菌、韋榮球菌、普氏菌等大類菌群的具體菌種差異上。在肺臟，微生物調節機體免疫防御病毒感染。在神經系統方面，微生物還通過減少突觸連接，調節焦慮和痛感等影響人類行為。

2 微生物組學研究主要技術

微生物組學是新興學科，它的發展與高通量基因測序和大數據的生物信息學分析密切相關。主要通過2種方式研究微生物組，一是通過16S rDNA基因序列的測定，提供一個全景式的微生物組成；二是通過宏基因組數據分析，深度揭示上述微生物已知和潛在的功能。

2.1 基于16S rDNA基因序列的微生物組學研究

16S rDNA的測序是近年來微生物生態領域最核心、最具突破性的技術。通過Roche 454焦磷酸測序、Illumina Solexa合成測序等第二代測序儀高通量測定16S rDNA可變區序列，獲得全面、系統、結構化的群落結構信息。該方法設計針對16S rDNA基因的V3?V1、V2?V4、V4、V3?V6、V9等不同區域的引物，通過PCR和高通量基因測序，生物信息學分析測序結果。大數據分析一般流程包括：序列提取、質控、相似序列聚類分析（operational taxo?nomic unit，OTU）、種屬分類、alpha以及beta多樣性分析等［18?19］，OTU是 16S rDNA 序列分析的關鍵控制點之一。

16S rDNA的測序通過提供豐富的全局性物種類群信息，可在微生物集群的層面揭示它們之間的相互作用。但方法局限在于注釋是基于OTU，一般情況下僅可將微生物分析到科或屬水平，不能精確地鑒定到物種水平。同時特定的基因并不直接測序，加之微生物間基因水平轉移和數量眾多未知菌株的存在［20?21］，極大地限制對未知微生物的發現和進一步研究。

2.2 基于微生物組學的宏基因組研究

基于全基因測序的宏基因組技術，通過鳥槍法高通量測序，可以在獲得菌群分類數據的同時采集到功能基因信息。此外該技術可以減少PCR擴增導致的偏差，原因在于檢測時一般直接測序。宏基因組數據分析常包括如下步驟：序列質控——序列組裝（也可不經組裝，直接比對目標數據庫）——比對檢測序列與已知微生物基因數據（統計門、綱、目、科、屬、種的分類和豐度）--比較物種多樣性（如采用PCA分析、聚類分析、篩選與樣品分組顯著相關因子）——分析基因組份（前噬菌體預測、可轉座原件、基因預測）——功能注釋（比對KEGG、egg?NOG、CAZy等數據庫，分析代謝通路、主要化合物活性酶、同源性）——抗生素耐藥組的比對分析等［22-24］。

宏基因組測序和16S rDNA測序盡管在菌群分布上基本一致［25］，但分辨率差異顯著。Ⅱ型糖尿病患者腸道菌群和對照人群在群落層面，并無顯著不同；而在功能基因上，宏基因組揭示的信息量卻顯著多于 16S rDNA 測序［4，26］。宏基因組技術仍然存在一些技術難題需要解決。首先，通過常規的序列相似度注釋基因功能，對某些基因而言不準確也存在一定量的誤注；其次，存在無法找到匹配的數據庫序列，這在病毒組由甚，有多達80%的序列無法找到匹配；再次，對于低豐度的菌株的微生物基因組，通過宏基因組難以將其進行組裝拼接。

3 臨床應用及檢驗需求

人類微生物組的基礎研究為本方向的臨床應用提供了堅實的基礎。本學科正處于從現象描述、關聯分析，到機制研究、模型干預，逐漸向疾病診斷、預測和治療的井噴式發展。該技術應用于臨床需要保證在不同實驗室之間結果的一致性，對檢驗前、中、后3個階段進行全程質量管理。

3.1 微生物組的臨床應用

在臨床應用人類微生物組可從3個側面展開：加法，即添加或補充自然或工程微生物菌群；減法，消減或消除宿主體內有害微生物菌群；調節治療，通過非生物制劑或益生元，調節宿主內源微生物群的組成和活性［27?28］。

益生菌和益生元構成的第一代微生物組療法已經在臨床得到了越來越多的應用［20?31］。Shanahan等［32］研究發現炎癥性腸道疾病患者與非患者之間的菌群存在顯著差異，通過對人體微生物組的干預和調整，達到治療和預防疾病的目的。在臨床上給患者喂服具有膽鹽水解酶活性的羅伊氏乳桿菌菌株，通過調節膽汁酸池水平從而降低膽固醇水平［33?34］。

消減療法可使用化學物質、多肽等去除患者體內特定的微生物種群。細菌素是由核糖體合成的抗菌肽，可以對易感菌產生細胞毒性。利用宏基因組學鑒定、篩選和使用對特定病原體定向殺滅細菌素，調節微生物種群［35?36］。另外，噬菌體療法通過自然或工程化的噬菌體殺滅特定細菌，細菌和噬菌體種群穩定共存于健康小鼠腸道［37］。

設計特定的微生物群系和選擇性的抗菌藥物所構成的新一代重組益生菌，已為廣大臨床微生物學家關注。通過修改益生菌的基因達到更好的治療效果，如表達N?酰基磷脂甲醇胺（N?acylphospha?tidylethanolamines）的大腸桿菌Nissle 1917基因工程益生菌小鼠，喂養高脂飲食時，相對于對照組可以減輕肥胖癥、胰島素耐受和脂肪肝的形成［38］。

3.2 微生物組的檢驗需求

2014年，Dominianni C等［39］進行微生物組分析時對糞便樣本的收集方法進行了研究。3個健康人的糞便樣本分4種采集方法進行了采集。一是采用便隱血檢測試劑卡，在室溫保存；二是放入Eppen?dorf管保存，在室溫保存；三是室溫下放入帶有RNAlate的Eppendorf管；四是樣品立即凍結在-80℃作為對照。所有樣本均在各自處理方式下保存3 d，后經16S rDNA基因測序。全面比較不同樣本處理方法的微生物類群分布和主要微生物類群的相對豐度，顯示低成本的便隱血檢測試劑卡可以做為糞便樣本可靠的采集方法。

樣本處理階段也可能產生附加DNA污染，分子生物學級別的實驗用水、PCR試劑和DNA提取試劑盒均是潛在的污染源。常見的污染微生物包括不動桿菌屬、產堿桿菌、芽孢桿菌、軍團菌、新鞘脂菌屬、假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、鞘氨醇單胞菌、草螺菌屬、短根瘤菌屬、中間根瘤菌屬、甲基桿菌、雷弗森菌、青枯菌屬、假平胞菌屬、狹長平胞菌［40?41］。

德國臨床微生物學家Hiergeist A等［42］在世界衛生組織臨床實驗室質量保證和標準化合作中心的幫助下，2014至2015年組織了9家來自奧地利、德國和挪威的實驗室進行了基于16S rDNA的糞便微生物組分析的室間質量評估。評估了包括標本采集、DNA的提取和純化、PCR擴增純化或濃縮、測序和生物信息學等多個過程。結果顯示不同實驗室之間在不同微生物類別DNA含量、不同微生物類別豐度、鑒定的菌株數量等方面均存在很大的差異。如不同微生物類別豐度在不同實驗室差別極大，厚壁菌門最高豐度78.14%，最低僅為45.98%；擬桿菌門最高豐度44.36%，最低僅為0.96%；放線菌屬最高豐度19.42%，最低僅為0.43%；變形菌門最高豐度2.5%，最低僅為0.27%［42］。

2015年3月，在歐洲盧森堡首都盧森堡市舉行的第五屆國際人類微生物組聯盟（internaltional hu?man microbiome congress，IHMC）學術會議上，就如何對臨床樣品收集、DNA提取、儲存和轉運等問題進行了探討。Thomas V教授指出建立全過程的標準化操作規程（standard operating procedure，SOP）至關重要。尤其是樣本采集和保存方法，將直接影響測序結果和數據分析。實驗室必須要確保每份研究樣品的合格有效。Sinha R教授通過開展微生物組質控項目（Microbiome QC，MBQC），依據不同實驗室的不同研究者在進行試驗（濕庫）和數據分析結果（干庫）所產生的差異，整理和評估不同的實驗方法和分析方法對實驗結果的影響。顯示，濕庫的差異比干庫造成的偏差更大，但對于單個樣品來說，這些差異并沒有影響數據的有效性［43］。

4 前景展望

人類微生物組學研究作為新興的發展方向，其在理論上和臨床應用上還有許多方面有待進一步深入。在人類健康與微生物的關系方面，不同群系微生物，在不同部位，對不同疾病，不同種族人群，不同年齡、性別人群的影響的科學解析，是否可以歸納出針對不同疾病的參考微生物群系的診斷圖譜或參數？在微生物組研究技術方面，強大的基因測序技術已經生成巨大的數據庫，如何采用新型的信息學技術挖掘？需要對其功能進行研究，特別是對大量基因功能信息的獲得、針對性基因的研究和新型微生物菌株的鑒定方面需要新的理論和算法作為支撐。在臨床應用上，迫切需要解決不同實驗室的相互比較的可行性。在樣本的采集、運輸、儲存，檢驗過程的方法選擇、性能評估，以及結果的輸出和臨床的應用上，均要取得業界的共識，形成一系列的SOP文本。為了保證結果的室間一致性，組織國際間或國內的室間質評計劃顯得十分必要。

［1］Gill SR，Pop M，DeBoy RT，et al.Metagenomic analy?sis of the human distal gut microbiome［J］.Science，2006，312（5778）：1355?1359.

［2］Ley RE，Peterson DA，Gordon JI.Ecological and evo?lutionary forces shaping microbial diversity in the hu?man intestine［J］.Cell，2006，124（4）：837?848.

［3］Cho I，Blaser MJ.The human microbiome：at the inter?face of health and disease［J］.Nat Rev Genet，2012，13（4）：260?270.

［4］Qin J，Li R，Raes J，et al.A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing［J］.Nature，2010，464（7285）：59?65.

［5］Arumugam M，Raes J，Pelletier E，et al.Enterotypes of the human gut microbiome［J］.Nature，2011，473（7346）：174?180.

［6］B?eckhed F，Ley RE，Sonnenburg JL，et al.Host?Bacterial Mutualism in the Human Intestine［J］.Sci?ence，2005，307（5717）：1915?1920.

［8］Stappenbeck TS，Hooper LV，Gordon JI.Develop?mental regulation of intestinal angiogenesis by indige?nous microbes via Paneth cells［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（99）：15451?15455.

［9］Shin NR，Whon TW，Bae JW.Proteobacteria：micro?bial signature of dysbiosis in gut microbiota［J］.Trends Biotechnol，2015，33（9）：496?503.

［10］Dominguez?Bello MG，Costello EK，Contreras M，et al.Delivery mode shapes the acquisition and structure of the initial microbiota across multiple body habitats in newborns［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（26）：11971?11975.

［11］Faith JJ，Guruge JL，Charbonneau M，et al.The long?term stability of the human gut microbiota［J］.Sci?ence，2013，341（6141）：1237439.

［12］Hsiao EY，McBride SW，Hsien S，et al.Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmentaldisorders［J］.Cell，2013，155（7）：1451?1463.

［13］Kang DW，Park JG，Ilhan ZE，et al.Reduced inci?dence of Prevotella and other fermenters in intestinal microflora of autistic children［J］.Plos ONE，2013，8（7）：e68322.

［14］Tükel C，Nishimori JH，Wilson RP，et al.Toll?like re?ceptors 1 and 2 cooperatively mediate immune respons?es to curli，a common amyloid from enterobacterial biofilms［J］.Cell Microbiol，2010，12（10）：1495 ?1505.

［15］Palaga T，Buranaruk C，Rengpipat S，et al.Notch sig?naling is activated by TLR stimulation and regulates macrophage functions［J］.Eur J Immunol，2008，38（38）：174?183.

［16］Li XX，Wong GL，To KF，et al.Bacterial microbiota profiling in gastritis without Helicobacter pylori infec?tion or non ?steroidal anti?inflammatory drug use［J］.Plos ONE，2009，4（11）：e7985.

［17］Nardone G，Compare D.The human gastric microbio?ta：Is it time to rethink the pathogenesis of stomach diseases？［J］.United Europ Gastro J，2015，3（3）：255?260.

［18］Sanschagrin S，Yergeau E.Next?generation Sequenc?ing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons［J］.J Vis Exp，2014，90（90）：e51709?e51709.

［19］Cole JR，Wang Q，Fish JA，et al.Ribosomal Data?base Project：data and tools for high throughput rRNA analysis［J］.Nucl Acids Res，2014，42（D1）：D633?D642.

［20］Kim Y，Koh I，Rho M.Deciphering the human micro?biome using next?generation sequencing data and bioin?formatics approaches［J］.Methods，2015，79?80：52?59.

［21］Konstantinidis KT，Tiedje JM.Prokaryotic taxonomy and phylogeny in the genomic era：advancements and challenges ahead［J］.Curr Opin Microbiol，2007，10（5）：504?509.

［22］Rho M，Tang H，Ye Y.FragGeneScan：predicting genes in short and error?prone reads［J］.Nucl Acids Res，2010，38（20）：e191.

［23］Markowitz VM，Chen IM，Palaniappan K，et al.IMG 4 version of the integrated microbial genomes compara?tive analysis system［J］.Nucl Acids Res，2014，42（D1）：D560?D567.

［24］Huang K，Brady A，Mahurkar A，et al.MetaRef：a pan?genomic database for comparative and community microbial genomics［J］.Nucl Acids Res，2014，42（D1）：D617?D624.

［25］Walker AW，Duncan SH，Louis P，et al.Phylogeny，culturing，and metagenomics of the human gut micro?biota［J］.Trends Microbiol，2014，22（5）：267?274.

［26］Wu X，Ma C，Han L，et al.Molecular characterisa?tion of the faecal microbiota in patients with type II dia?betes［J］.Curr Microbiol，2010，61（1）：69?78.

［27］Marsland BJ，Gollwitzer ES.Host?microorganism in?teractions in lung diseases［J］.Nat Rev Immunol，2014，14（2）：827?835.

［28］Shreiner AB，Kao JY，Young VB.The gut microbi?ome in health and in disease［J］.Curr Opin Gastroen?terol，2015，31（1）：69?75.

［29］Mimee M，Citorika RJ，Lu TK，et al.Microbiome therapeutics—Advances and challenges［J］.Adv Drug Deliv Rev，2016，105（Pt A）：44?54.

［30］Varankovich NV，Nickerson MT，Korber DR.Probiot?ic?based strategies for therapeutic and prophylactic use against multiple gastrointestinal diseases［J］.Front Mi?crobiol，2015，6（1）：1?14.

［31］Frei R，Akdis M，O'Mahony L.Prebiotics，probiot?ics，synbiotics，and the immune system［J］.Curr Opin Gastroenterol，2015，31（2）：153?158.

［32］Shanahan F，Quigley EM.Manipulation of the micro?biota for treatment of IBS and IBD?challenges and con?troversies［J］.Gastroenterology，2014，146（6）：1554?1563.

［33］Gevers D，Kugathasan S，Denson LA，et al.The Treatment?Naive microbiome in New ?Onset crohn's disease［J］.Cell Host Microbe，2014，15（3）：382 ?392.

［34］Jones ML，Martoni CJ，Prakash S.Cholesterol lower?ing and inhibition of sterol absorption by Lactobacillus reuteri NCIMB 30242：a randomized controlled trial［J］.Eur J Clin Nutr，2012，66（11）：1234?1241.

［35］Millette M，Cornut G，Dupont C，et al.Capacity of human nisin?and pediocin?producing lactic acid bacte?ria to reduce intestinal colonization by vancomycin?re?sistantenterococci［J］.ApplEnviron Microbiol，2008，74（7）：1997?2003.

［36］Kommineni S，Bretl DJ，Lam V，et al.Bacteriocin production augments niche competition by enterococci in the mammalian gastrointestinal tract［J］.Nature，2015，526（7575）：719?722.

［37］Maura D，Morello E，du Merle L，et al.Intestinal col?onization by enteroaggregative Escherichia coli sup?ports long?term bacteriophage replication in mice［J］.Environ Microbiol，2012，14（8）：1844?1854.

［38］Chen Z，Guo L，Zhang Y，et al.Incorporation of ther?apeutically modified bacteria into gut microbiota inhib?its obesity［J］.J Clin Invest，2014，124（8）：3391?3406.

［39］Dominianni C，Wu J，Hayes RB，et al.Comparison of methods for fecal microbiome biospecimen collec?tion［J］.BMC Microbiology，2014，14（1）：103.

［40］Laurence M，Hatzis C，Brash DE.Common contami?nants in nextgeneration sequencing that hinder discov?ery of low?abundance microbes［J］.PLoS One，2014，9：e97876.

［41］Salter SJ，Cox MJ，Turek EM，et al.Reagent and lab?oratory contamination can critically impact sequence?based microbiome analyses［J］.BMC Biology，2014，12（1）：87.

［42］Hiergeist A，Reischl U.Multicenter quality assessment of 16S ribosomal DNA?sequencing for microbiome analyses reveals high inter?center variability［J］.Int J Med Microbiol，2016，306（5）：334?342.

［43］李蘭娟.國際人類微生物組最新研究進展—第五屆國際人類微生物組聯盟學術會議紀要［J］.中華臨床感染病雜志，2015，8（2）：188?192.