ERK途徑參與未受精蠶卵的孤雌激活

翁宏飚，牛寶龍

（浙江省農業科學研究院 蠶桑所，浙江 杭州 310021）

自從上世紀三十年代發現蠶卵在一定條件下，可少量發生孤雌發育的現象以來，人們開展了大量的家蠶未受精卵的孤雌誘導實驗，通過優化誘導條件，篩選易發品系，建立起高效的家蠶孤雌生殖體系［1～3］。在國內，對家蠶種質庫中的保存品種進行篩選，并通過連續多代的選擇，建立起全球最大的家蠶孤雌生殖種質資源庫，培育的孤雌生殖家蠶品種進入生產實用［4］。在開展家蠶孤雌生殖應用研究的同時，家蠶孤雌生殖機理的研究也在不斷探索中。通過家蠶孤雌生殖發育蠶卵的細胞學研究，發現46℃、18 min的熱激處理，可以使阻滯于第一次減數分裂的染色體結構解體，同源染色體不再分離，直接進入第二次減數分裂模式，染色單體相互分離，從而使得子代染色體組保持與親代相同的2 n［2］。日本學者研究發現，在家蠶嵌合體突變品系的孤雌生殖中，同時存在極體自受精和不完全減數分裂兩種機制，而在可自發發生孤雌生殖的品系M90中，其孤雌生殖發育則主要為不完全減數分裂機制［5］。孤雌生殖品系的轉錄組學研究結果顯示，許多調控途徑參與了家蠶熱激誘導的孤雌生殖發育［6］。

卵母細胞成熟調控是一個復雜的多因子調節過程。在脊椎動物中，卵細胞分裂阻滯于第2次成熟分裂中期，等待受精活化［7］。而在無脊椎動物中，卵母細胞發育過程中的第2次分裂阻滯發生在第1次成熟分裂中期［8］。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activat?ed protein kinase cascade，MAPK）信號通路是細胞間信號傳遞的重要通路，參與細胞形態、細胞分化及細胞周期的各個環節［9］。MAPK在卵細胞減數分裂的MⅠ期/MⅡ期轉變過程中保持活性，是調節卵母細胞減數分裂的中樞［10］。已有大量研究發現，MAPK信號途徑參與脊椎動物卵細胞的人工活化過程［11～12］，在卵受精或孤雌活化后，MAPK發生去磷酸化而失活，分裂阻滯解除，細胞恢復分裂。在對無脊椎動物葉蜂的研究中發現，MAPK信號途徑參與葉蜂的孤雌生殖發育，蜂卵經人工孤雌激活，分裂阻滯解除后，隨著發育時間的延長，磷酸化修飾的MAPK和MEK含量逐漸下降，激活后50 min，已檢測不到磷酸化修飾的激酶［13］。定量比較MAPK信號通路基因在有性生殖品系與孤雌生殖品系間的表達差異，結果顯示信號通路基因的表達，在兩個品系間存在顯著性差異，暗示MAPK信號通路可能參與了家蠶孤雌生殖發育［14］。

MAPK信號通路的核心是幾種蛋白激酶的順序磷酸化激活，MEK是催化MAPK磷酸化修飾的直接分子［15］。U0126是MEK1/2的高效特異性抑制劑。對葉蜂卵的研究中發現，以抑制劑U0126處理蜂卵，可以降低卵內MAPK的磷酸化水平，解除卵細胞分裂阻滯，誘導恢復分裂，達到孤雌誘導的效果［13］。家蠶孤雌生殖首先需要通過熱激處理，解除細胞分裂阻滯，恢復細胞分裂過程，而后在各種機制的維護下完成胚胎發育。本研究以不同濃度的U0126注射羽化前不同時期的雌蛹，羽化后收集未受精卵，46℃、18 min熱激誘導孤雌生殖，調查未受精卵的轉色率、孵化率指標，結果顯示U0126可以促進未受精卵孤雌生殖激活后早期胚胎的發育，提高蠶卵的轉色率。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

家蠶孤雌生殖品系無14是原種54A，經連續多代熱激（46℃，18 min）誘導篩選出的PL品系；多化性品系Nastari為浙江省農科院蠶桑所保存蠶品種。

抑制劑U0126購自Selleck公司（美國），溶劑DMSO購自上海生工，未受精卵熱激用水浴、恒溫恒濕箱購自上海博訊公司；protoCOL自動菌落計數儀（synbiosis，Cambridge，UK）為農科院質量標準研究所儀器。

1.2 方法

將U0126粉劑溶于DMSO，配制成10 mmol母液，于-20℃分管保存。使用時用PBS緩沖液稀釋成工作液備用。

熟蠶上蔟結繭后，削繭鑒蛹，雌蛹常規保護至復眼著色。取10 g消特靈粉劑溶于2 L蒸餾水中，配制成蛹體消毒液。將復眼著色雌蛹浸入消毒液中1 min，撈出后放在干凈的吸水紙上晾干保護。在羽化前2 d，按每蛹20 μL的注射量，給雌蛹注射U0126工作液并常規保護至羽化，每個濃度注射10顆雌蛹。蠶卵孤雌生殖誘導及蠶卵保護參照［4］方法進行。由于無14品系孤雌生殖發育良好，蠶卵發育調查時，隨機稱取0.1克蠶卵，統計良卵率和孵化率；多化性品系Nastari蠶卵發育初期不著色，在孵化前2～3 d開始轉色。考慮到Nastari孤雌生殖蠶卵的發育較有性生殖蠶卵慢，因此在有性生殖蠶卵孵化后一周，隨機稱取0.15 g蠶卵，均勻攤于8 mm平皿中，用菌落計數儀統計轉色蠶卵數，并計算單位重量的轉色蠶卵數量，用于統計分析。儀器的設置為：曝光時間：40 ms；排除小顆粒：小于0.1 mm。每個實驗均設3個重復。采用SPSS軟件進行差異顯著性分析。

圖1 U0126處理后孤雌生殖品系無14良卵率和孵化率Figure 1 Good egg rate and hatching rateof Wu14with U0126treating

2 結果與分析

2.1 品系無14的孤雌生殖激活

2017年春蠶期，無14上蔟結繭后，于6月3日注射雌蛹，6月5日羽化，常規取卵，孤雌生殖誘導，蠶卵保護及入庫冷藏，8月15出庫調查并開始催青。蠶卵調查結果如圖1。

抑制劑U0126處理孤雌生殖品系無14后，高濃度組的良卵率指標與對照組的相仿，但低濃度組及有機溶劑DMSO組的良卵率顯著下降。蠶卵孵化率指標，對照組與高濃度組無統計差別，而低濃度組及溶劑組則極顯著降低。

2.2 品系Nistari的孤雌生殖激活

2017年秋蠶期，于9月13日注射處理Nistari雌蛹，9月15日羽化，收集未受精卵并進行孤雌生殖熱激誘導，因Nastari品系孤雌生殖孵化率極低，而且蠶卵早期不著色，為判斷發育進度，設置有性生殖蠶卵對照，同步蠶卵保護及催青，有性生殖蠶卵孵化后一周，用自動菌落計數儀調查孤雌生殖的發生情況。結果如圖2。

雖然Nistari經U0126處理后，各處理組均無孵化，但各組的蠶卵轉色情況并不相同。20 μmol/L處理組蠶卵轉色極顯著優于其他處理組；10 μmol/L處理組極顯著好于5 μmol/L組和對照組；5 μmol/L組和對照組的單位卵重轉色卵數則極顯著高于溶劑對照組和1 μmol/L處理組。

3 討論

目前家蠶孤雌生殖發育的調查指標主要有蠶卵著色率（孤雌生殖發生率）及催青后孵化率。普通蠶品種在受精或孤雌生殖激活后，細胞恢復分裂并開始胚胎發育約24 h～28 h，卵內漿膜形成后轉為固有色，再經10 d左右催青而后孵化。現有蠶品種經熱激誘導后，有較高的未受精卵著色率，平均蠶卵著色率為50%左右［4，16-17］，部分蠶卵能發育到轉青期和點青期，但極少孵化。本實驗所用的Nistari是多化性熱帶白卵蠶品種，蠶卵激活開始發育后，早期蠶卵不轉色，催青第7 d-8 d左右，蠶卵出現少量著色，在有性生殖蠶卵孵化后5 d內，孤雌生殖蠶卵顏色仍在變化，7 d后蠶卵顏色變化不大。因此，實驗中在有性生殖蠶卵孵化后第7 d，調查孤雌生殖蠶卵的轉色情況，作為Nistari孤雌生殖發育的指標。

圖2 U0126處理后，每克孤雌生殖蠶卵中的著色卵數Figure 2 Amount of coloring eggs in each gram of parthenogenesis eggs with U0126 treating

本實驗中，經高、中濃度抑制劑處理后，Nistari品系的轉色卵比例極顯著高于對照。已有的研究顯示，家蠶的遺腹卵率大約在10%～15%左右［18］，雖然遺腹卵不等同于未成熟卵，但不能排除大部分遺腹卵屬于未成熟卵，孤雌生殖誘導后不能著色而成為不良卵。考慮到用于孤雌生殖誘導的未受精卵為解剖卵，包含了全部未成熟卵，因此抑制劑處理后無14良卵率的提高雖未達顯著水平，但可以確定U0126處理可以使得更多蠶卵被激活而進入胚胎發育，或有利于孤雌生殖蠶卵的發育。Nistari低濃度組和溶劑組的轉色卵指標極顯著低于對照組，以及無14低濃度組和溶劑組的良卵率顯著低于對照組，可能是由于DMSO的細胞毒性，抑制了胚胎發育造成的。而且DMSO的細胞毒性在無14孵化率上也有體現：在低濃度組和溶劑組中，無14的孵化率極顯著地低于對照組。另外，Nistari品系的不滯育和卵發育后期轉色的特點，是合適的家蠶孤雌生殖研究材料。

顯微觀察孤雌生殖轉色卵，可見蠶卵呈現塊狀或帶狀著色斑，而不是有性生殖蠶卵的完全著色形式，因此在統計著色卵指標時，可能因統計人員的不同，而出現不同的統計結果，影響結果分析。本研究中，利用自動菌落計數儀，通過設置合適的參數，可以客觀、高效地統計著色卵數，因而該系統可以在家蠶孤雌生殖研究中應用。

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