RNAi技術(shù)在作物改良的應(yīng)用與展望

王泳植 盧堯舜 王錦達(dá)

摘要：指出了傳統(tǒng)方式培育出的農(nóng)作物已難以滿足現(xiàn)代市場(chǎng)的需求，很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，研究人員都被改艮作物品質(zhì)用時(shí)長(zhǎng)、耗費(fèi)高、程序繁雜等問(wèn)題所困擾，RNAi（ RNA interference）技術(shù)的出現(xiàn)，讓這些問(wèn)題的解決取得了飛速進(jìn)展。RNAi能沉默特定基因的表達(dá)，且擁有極高的精度和準(zhǔn)度，通過(guò)RNAi技術(shù)，特定基因的表達(dá)可被高度下調(diào)，且不會(huì)影響其他基因。通過(guò)操縱RNA干擾的途徑，產(chǎn)生小RNA分子來(lái)改良作物中的基因表達(dá)，可以產(chǎn)生新的品質(zhì)性狀，且在抵御生物和非生物脅迫方面有較高潛力。營(yíng)養(yǎng)成分的改良，形態(tài)學(xué)上的改變和次生代謝物合成的增加，是RNAi技術(shù)另一方面的優(yōu)勢(shì)。綜述了RNAi技術(shù)在作物改良的各方面應(yīng)用，探討了RNAi技術(shù)存在的問(wèn)題，并對(duì)RNAi技術(shù)在作物改良方面的未來(lái)前景作了展望。

關(guān)鍵詞：RNAi;作物改良;株型;營(yíng)養(yǎng)成分;脅迫抗性

中圖分類號(hào)：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-9944（2018）14-0239-04

1 引言

人類賴以生存的資源很大一部分來(lái)源于植物及其加工后的產(chǎn)物，隨著世界人口的增加，對(duì)于植物的需求與日俱增。耕地和水源的減少、生物及非生物脅迫、氣候變化等是抑制植物健康生長(zhǎng)、減少植物產(chǎn)量的主要限制因素，這將導(dǎo)致未來(lái)的糧食安全問(wèn)題，人體營(yíng)養(yǎng)不良甚至饑荒。為了克服這些問(wèn)題，開(kāi)展現(xiàn)代育種技術(shù)、分子遺傳學(xué)、DNA重組和生物技術(shù)的研究，以期獲得具有病害抗性、耐脅迫和高產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)的作物品種，生物技術(shù)的應(yīng)用，尤其是基因工程，為作物改良帶來(lái)了重要突破。然而，基因工程技術(shù)在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用，是否符合生物安全準(zhǔn)則，以及向作物巾導(dǎo)入其他有機(jī)體的基因所帶來(lái)的影響引起了公眾的關(guān)注，因此，有必要發(fā)展一種更加安全、更能被公眾所接受的作物改良技術(shù)。基于這點(diǎn)，RNAi技術(shù)引起了研究人員的廣泛關(guān)注，相比于基因工程技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)具有穩(wěn)定性高、特異性強(qiáng)、效率高等優(yōu)點(diǎn)，在作物改良方面有巨大潛力。就RNAi技術(shù)在作物改良的應(yīng)用進(jìn)行討論，對(duì)這項(xiàng)技術(shù)的問(wèn)題及其前景進(jìn)行展望。

2 RNAi的作用機(jī)制

外源基因利用宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生雙鏈RNA（ dsRNA），dsRNA隨后被細(xì)胞內(nèi)的核酸內(nèi)切酶切割成小片段RNA（ siRNA）;在RNA解旋酶的作用下，siRNA被解鏈為正義鏈和反義鏈;反義siRNA結(jié)合某些酶形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）;RISC結(jié)合mRNA的同源區(qū)并切割mRlxIA，宿主細(xì)胞隨即針對(duì)這些mRNA產(chǎn)生降解反應(yīng)。

3 RNAi在作物改良中的應(yīng)用

3.1植物株型的改變

株型的改變包括株高、分枝、莖長(zhǎng)和花葉形態(tài)等，它們與重要的農(nóng)藝性狀如產(chǎn)量、生理生化過(guò)程、倒伏以及對(duì)抗環(huán)境脅迫的能力有關(guān)。

Xu等在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，不定根出苗和生長(zhǎng)在OsPINl RNAi轉(zhuǎn)基因作物中受到嚴(yán)重抑制，通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法，OsPINl基因在水稻內(nèi)的過(guò)度表達(dá)或抑制會(huì)導(dǎo)致分蘗數(shù)和根冠比的改變，說(shuō)明OsPINl基因在不定根出苗和分蘗中起重要作用。Qiao等通過(guò)RNAi抑制了水稻中OsGA20ox2基因（編碼植物巾調(diào)節(jié)赤霉素合成的酶GA 20-氧化酶）的表達(dá)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因水稻中的一個(gè)表型表達(dá)低量的GA1，這種表型株高降低并形成一種半矮桿的表型，與野生型相比，莖稈更短，抗倒伏能力強(qiáng)，且生產(chǎn)率更高。Hu等的研究表明水稻組蛋白脫乙酰酶（ HDAC）基因的過(guò)度表達(dá)并不會(huì)產(chǎn)生有顯著特點(diǎn)的表型，然而，通過(guò)miRNA使HDA703表達(dá)下調(diào)，減少了水稻花梗的伸長(zhǎng)，RNAi沉默HDA704后，導(dǎo)致了水稻株高和葉型的改變。

3.2營(yíng)養(yǎng)成分改善

世界范圍內(nèi)數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的人口被慢性饑餓所影響，在發(fā)展中國(guó)家營(yíng)養(yǎng)不良是最主要的問(wèn)題，其中微量元素的缺乏會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重疾病甚至死亡。一種可行的解決方案是改善主食的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，然而這些食物如水稻、玉米、小麥和豆類雖然能提供足夠的卡路里和蛋白質(zhì)，但并不是營(yíng)養(yǎng)全面的作物，僅食用這類作物會(huì)導(dǎo)致維生素和礦物質(zhì)的缺乏，例如主食米飯的人更易缺乏維生素A和鐵元素。利用生物技術(shù)進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)成分改良的安全件值得懷疑，因此這種方法的使用受到限制。RNAi因其高安全性，可用于改善作物的營(yíng)養(yǎng)成分。

Eck等通過(guò)RNAi技術(shù)沉默了馬鈴薯中β-胡蘿卜素羥化酶（BCH，能使β一胡蘿卜素轉(zhuǎn)變成玉米黃質(zhì)）基因，從而增加了β-胡蘿卜素的含量。過(guò)度食用高淀粉含量食品會(huì)導(dǎo)致二型糖尿病，直鏈淀粉不易被消化，不會(huì)顯著增加餐后血糖，Regina等通過(guò)RNAi技術(shù)，生產(chǎn)了四種含有高直鏈淀粉含量的玉米品系。棉子酚對(duì)人類具有毒性，是降低棉籽價(jià)值的主要因素，Palle等利用RNAi技術(shù)沉默了陸地棉（Gossypium hirsutum）中δ-杜松烯合成慕因的表達(dá)，產(chǎn)生了超低含量棉子酚的棉籽。馬建等為改良大豆品質(zhì)，采用RNAi技術(shù)沉默了籽粒中脂肪氧化酶基因的表達(dá)，脂肪氧化酶活性降低，使大豆油粉含量得到提高。

3.3 非生物脅迫耐受性

環(huán)境脅迫因子如干旱、鹽堿、水澇和氣溫大幅波動(dòng)是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力最主要的因素之一，對(duì)新基因的探尋，對(duì)其功能和脅迫應(yīng)答反應(yīng)的研究，能為培育耐高強(qiáng)度非生物脅迫作物提供基礎(chǔ)。RNAi因其優(yōu)異特性，已在多種植物的耐受性研究中得到應(yīng)用，而miRNA在植物應(yīng)對(duì)非生物脅追時(shí)有重要作用。

Jian等從水稻品種Oryza sativa L.中鑒定出新的與脅迫應(yīng)答有關(guān)的miRNIAs，這些miRNAs能在水稻應(yīng)對(duì)嚴(yán)寒、脫水和鹽堿時(shí)參與到應(yīng)答通路中。番茄紅素-β -環(huán)化酶（LCY-β）是一種通過(guò)番茄紅素的環(huán)化，參與α-和β一類胡蘿卜素合成的關(guān)鍵酶，IbLCY-β基因與LCY-β有80%的序列同源性，Kim等將IbLCY-β一RNAi載體導(dǎo)入番茄愈傷組織，發(fā)現(xiàn)與未導(dǎo)入該載體的愈傷組織相比，抗干旱和鹽堿的能力顯著提高。Song等研究轉(zhuǎn)錄因子OsNAC5在水稻對(duì)非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)中的作用時(shí)，觀察通過(guò)RNAi技術(shù)沉默OsNAC5后的品種，過(guò)量表達(dá)OsNAC5的品種，野生品種在嚴(yán)寒、干旱和鹽堿等脅迫下的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)沉默Os-NAC5后的品種耐受性最差，過(guò)量表達(dá)OsNAC5的品種耐受性最強(qiáng)。

通過(guò)RNAi技術(shù)能確定參與脅迫應(yīng)答的關(guān)鍵因子，更好的理解植物抗環(huán)境脅迫的原理，為培育高環(huán)境脅迫耐性作物提供基礎(chǔ)。

3.4生物脅迫抗性

植物長(zhǎng)期受到生物環(huán)境因子包括病毒、細(xì)菌、真菌病原體、寄生性植物和食草昆蟲(chóng)等的攻擊，嚴(yán)重限制了作物的生產(chǎn)力，對(duì)經(jīng)濟(jì)和生態(tài)造成嚴(yán)重影響，增強(qiáng)植物的生物脅迫抗性具有重要意義。許多小RNA（ sRNAs）積累在植物組織中，盡管在大小，序列，基因組中的分布不盡相同，但大多數(shù)sRNAs都能通過(guò)RNA沉默來(lái)抑制基因的調(diào)控，RNAi技術(shù)能在植物生物抗性的提高方面做出巨大貢獻(xiàn)。

Schwind等研究出能通過(guò)生產(chǎn)小發(fā)卡RNA （hpRNA），從而對(duì)馬鈴薯紡錘類病毒（PSTVd）產(chǎn)生抗性的馬鈴薯品種。Fairbairn等在研究應(yīng)對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的策略時(shí)，通過(guò)使轉(zhuǎn)基因馬鈴薯表達(dá)針對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子Mj Tisll的hpRNA，沉默了Mj Tisll的表達(dá)，為食草害蟲(chóng)的治理開(kāi)辟了新道路。Li等用能沉默褐飛虱和玉米螟體內(nèi)目標(biāo)基因的dsRNA浸泡水稻和玉米的根部，并給害蟲(chóng)喂食浸泡根部后的植物，發(fā)現(xiàn)害蟲(chóng)死亡率顯著上升，說(shuō)明可利用根部浸泡dsRNA的方法抵御害蟲(chóng)。

3.5次生代謝物的合成

植物次生代謝物質(zhì)是一種能對(duì)人類健康產(chǎn)生影響的膳食成分，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，通過(guò)RNAi技術(shù)淵控對(duì)次生代謝物產(chǎn)生具有重要作用的多個(gè)基因，是一種高效的方法。

青蒿素是一種從青蒿（Artemisia carvifolia）中提取出的高效抗瘧疾藥物，然而青蒿素在A.carvlfolia中的含量卻很低，鯊烯合酶（ SQS）是甾醇合成途徑中的關(guān)鍵酶，與青蒿素的合成為競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，Zhang等通過(guò)hpRNA介導(dǎo)的RNAi技術(shù)成功抑制了sos基因的表達(dá)，從而增加了A. carvifolia中青蒿素的含量。馬鈴薯糖蛋白是一種蛋白酶抑制劑，屬于馬鈴薯塊莖蛋白的一種，馬鈴薯塊莖可作為人體治療性糖蛋白合成的生物反應(yīng)器，Kim等利用RNAi技術(shù)減少了馬鈴薯糖蛋白的含量，將馬鈴薯塊莖改造成一種高效的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。芥子油苷是芥菜（Brassica juncea）中的一種抗?fàn)I養(yǎng)成分，且會(huì)降低進(jìn)餐適口性，一般含量為80～120μmol/g，BjMYB28是參與芥子油苷合成的基因，Augustine，等通過(guò)RNAi技術(shù)沉默了BjMYB28的表達(dá)，將B.juncea中芥子油苷的含量降至11. 26μmol/g。

3.6有害成分的移除

無(wú)論是人工培養(yǎng)的還是自然牛長(zhǎng)的作物，都含有某些有害物質(zhì)，而清除這些有害物質(zhì)又是一項(xiàng)繁雜的工作，RNAi技術(shù)在移除植物有害成分方面有著廣泛地應(yīng)用。

棉花是生產(chǎn)纖維和食用油的重要來(lái)源，而棉子酚是棉花中的毒性成分，Sunilkumar等通過(guò)sRNAs沉默了參與棉子酚合成的杜松烯合成基岡，降低了棉籽和棉籽油中棉子酚的含量。植物螯合肽（PCs）在重金屬合成中有重要作用，為了降低水稻的鎘含量，Li等用RNAi技術(shù)沉默了參與PCs合成的基因OsPCSl的表達(dá)，與普通水稻相比，RIxIAi水稻的鎘含量降低了半。煙草中的N-亞硝基降煙堿（NNN）有致癌作用，在煙草中通過(guò)尼古丁N-脫甲基酶（ NND）合成，Lewis等利用RNAi技術(shù)沉默了NND基因的表達(dá)，使RNAi煙草的NNN含量與普通煙草相比降低了6倍。

3.7 水果貯藏壽命的延長(zhǎng)

水果是膳食營(yíng)養(yǎng)中一種重要的補(bǔ)充成分，然而水果在收獲后處理的過(guò)程中會(huì)遭受巨量的損失，在世界范圍內(nèi)可達(dá)到數(shù)十億美元，許多基因不僅參與到了水果成熟的過(guò)程中，還與水果的腐敗有關(guān)，延緩水果的后熟進(jìn)程已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。

果膠裂解酶（ PelC）能有效改善果肉硬度，Yang等鑒定了22種馬鈴薯中的PelC基因，發(fā)現(xiàn)SIPL在馬鈴薯成熟過(guò)程中顯著表達(dá)，利用RNAi技術(shù)沉默了SIPL，增強(qiáng)了馬鈴薯果肉硬度并延長(zhǎng)了貯藏壽命。Elitzur等通過(guò)RNAi技術(shù)沉默了與香蕉成熟有關(guān)的MaMADSl和MaMADS2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)香蕉變色和變軟的過(guò)程延長(zhǎng)，成功培育出成熟延緩、貯藏期延長(zhǎng)的表型。

4結(jié)語(yǔ)

RNAi技術(shù)具有效率高，穩(wěn)定性高，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，使其相比于傳統(tǒng)的基因工程技術(shù)，在作物改良方面具有更廣泛的應(yīng)用。RNAi技術(shù)能對(duì)作物株型做出定向改變，使作物具有理想的農(nóng)藝性狀;能增強(qiáng)作物非生物脅迫耐受性與生物脅迫抗性，提高生活力;能改善營(yíng)養(yǎng)成分并移除有害成分，增加對(duì)人體的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值;能增加次生代謝物的合成，提高作物經(jīng)濟(jì)價(jià)值;還能延長(zhǎng)水果貯藏壽命，減少收獲后處理造成的經(jīng)濟(jì)損失。

5展望

盡管RNAi技術(shù)在作物改良方面具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但該技術(shù)存在的問(wèn)題還需進(jìn)一步研究并解決，豐要存在的問(wèn)題有：①有效siRNA的設(shè)計(jì)與合成;②有效干擾載體的構(gòu)建;③某些RNA靶序列可能位于高度折疊的區(qū)域，或隱藏在二級(jí)結(jié)構(gòu)下，不易接近siRNA，被識(shí)別并切割;④某些蛋白質(zhì)會(huì)與RNA序列形成緊密復(fù)合物，阻礙siRNA識(shí)別這些序列;⑤某些基因與靶基因同源性較高，會(huì)被錯(cuò)誤的沉默。

隨著研究人員對(duì)植物基因組不斷深入的研究和對(duì)RNAi技術(shù)的理解與逐步完善，再結(jié)合RNAi技術(shù)本身具有的高特異性、高穩(wěn)定性及高安全性等優(yōu)點(diǎn)，RNAi技術(shù)將會(huì)在植物特定基因的功能研究中占有越來(lái)越重要的地位.也會(huì)在作物改良方面有更加廣泛的應(yīng)用，為研究人員帶來(lái)重要的科研價(jià)值并為改善國(guó)民生活作出巨大貢獻(xiàn)。