復雜色譜信號自動解析中的化學計量學方法

杜國榮 ，董怡青，李 跑*

(1.湖南農業大學 食品科學技術學院，食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.上海煙草集團有限責任公司技術中心 北京工作站，北京 101121)

色譜及其聯用技術，如氣相色譜-質譜(GC-MS)、高效液相色譜/二極管陣列檢測器(HPLC/DAD)以及高效液相色譜-質譜(HPLC-MS)等得到了飛速發展，在復雜環境、醫藥、生物樣品分析中得到了廣泛應用，并向高通量、簡單、快速、靈敏、低成本的方向發展[1-3]。其中，自動化色譜分析是現階段研究的重點和難點。自動化色譜分析研究主要通過采用自動化的進樣方式、改進分離分析模式或儀器的硬件結構來實現快速和批量分析。一方面采取合理的樣品前處理方法，以實現待測物與干擾物的分離，另一方面采取先進的分離手段，以實現待測組分之間的完全分離。這些手段在硬件方面為自動化檢測奠定了基礎。此外，自動化的色譜解析以及組分的定性和定量分析必須有可靠的數據采集和處理軟件作保證。然而，在自動化色譜分析的軟件方面存在較多問題：一方面對于儀器得到的復雜二維或更高維數據的分析相較于一維數據的分析并未得到同等的重視，即使采用了先進的自動化進樣技術和分離手段，對于復雜數據的分析仍需大量人力來實現；另一方面，由于分析對象的復雜性，低含量組分的信號易受到其它干擾組分的影響而導致無法實現準確的定性定量分析[4]。

化學計量學在背景噪聲的自動化扣除或組分信息的自動化提取領域取得了卓越的成效，為復雜色譜信號自動化解析提供了新思路。針對復雜色譜信號的解析問題，科學家建立了多種化學計量學方法，如化學因子分析[5-6]、多元曲線分辨-交替最小二乘法[7]、小波變換[8]、免疫算法[9-10]等。但現有的化學計量學方法并不能完全有效地實現復雜體系色譜信號的自動化解析。其主要原因在于：①對操作者的各類解析方法熟悉度要求較高。大部分化學計量學方法參數較多，需人工干預才能達到較好的解析目的，提高了對操作者的經驗要求；②對于干擾嚴重的色譜信號，大多數化學計量學方法解析效率較低、時間長，甚至不能有效實現信號的準確解析，因而不能滿足復雜色譜信號的自動化解析需求。

圖1 色譜數據自動化分析程序Fig.1 Flowchart of automated chromatographic data analysis

為此，自動化色譜解析算法成為科研工作者關心的重點，大量自動化解析算法被提出[11-50]。如圖1所示，色譜數據自動化分析程序主要包括4部分：自動色譜峰識別(Automatic chromatographic peak detection,ACPD)、背景以及基線漂移校正(Background drift correction,BDC)、色譜譜峰漂移校正以及重疊色譜峰的解析[11-12]。本文對近年來發展的復雜色譜信號自動化解析中與這四部分相關的化學計量學方法原理與應用進行了總結與評述。

1 自動色譜峰識別研究新進展

色譜信號中組分的定性與定量分析的關鍵在于色譜峰的準確識別。色譜圖中每個色譜峰對應一個組分，但由于儀器和環境因素的影響，譜圖中常出現未能完全分離的重疊色譜峰以及不規則峰形，如前肩峰、后肩峰、拖尾峰甚至負峰等。這些不規則峰的出現加大了ACPD分析的難度。近年來針對一維以及二維色譜數據，國內外學者提出了許多適合于ACPD的新算法，已有研究主要集中在對導數法的改進以及發展基于質譜信號的ACPD算法兩部分。

基于一維色譜信號的ACPD分析算法可分為兩類：基于色譜峰基本物理特性而建立的ACPD算法和基于小波變化的ACPD算法。前者主要利用色譜信號的信噪比、色譜峰形狀(高斯擬合)和一階/二階導數實現色譜峰的ACPD解析；后者主要基于色譜信號中各組分的信息在時域或頻率域中存在的差別，采用小波分析將色譜信號分解從而提取各組分的色譜信息。在基于色譜峰基本物理特性的ACPD算法研究中，Boe[13]提出了一種改進的泊松模型方法——面積重現法。該方法直接從實驗色譜信號中計算得到模型的參數且不改變譜峰的形狀和大小，可用于快速識別色譜峰。但該方法采用同一峰形參數來擬合信號中的所有譜峰，從而忽略了組分間色譜峰的差異，易給解析結果造成較大偏差。Vivó-Truyols等[14]提出了一種基于高階導數的ACPD方法，以一階導數為基礎確定組分的洗脫區域，而色譜峰的快速識別則采用二階導數實現。但該方法依舊無法實現有效的ACPD分析，原因在于該方法需加入經驗確定的閾值來實現噪聲和組分信號的區分。為此，劉明明等[15]將原本的ACPD方法結合面積重現法，提出了全新的ACPD算法，較好地實現了復雜色譜如煙氣譜圖等的ACPD分析，且在一定的范圍內能識別大量復雜譜峰中湮沒的未知組分信息及其大致量。此外，由于色譜峰在平滑窗口中具有局部最大值，因此Fu等[16]基于多尺度高斯平滑建立了一種新型的ACPD方法，可以實現復雜色譜信號中組分信息的準確提取。對于基于小波變化的ACPD分析方法研究，Zhang等[17]通過充分利用小波空間的附加信息，提出了多尺度譜峰檢測(Multi-scale peak detection,MSPD)的方法，并分別采用Python和Cython對算法進行了編寫，結果表明該方法可以大大提高復雜色譜信號ACPD分析的準確性。然而以上基于一維色譜信號解析的方法在對復雜色譜信號進行ACPD分析時，大多不能直接檢測兩峰是否重疊，需用戶設置某個參數加以判斷。此外，這些方法的解析效率較低，無法實現大量數據的自動化分析。針對低信噪比的信號解析，這些算法大多不能得到正確的結果。

GC-MS是現階段應用最多的色譜聯用技術之一。相對于色譜信號的不穩定，質譜信號中不易出現基線和色譜峰漂移的影響，且存在已建立完善的標準質譜庫，因此更適于ACPD分析。Miao等[18]基于目標因子分析(Target factor analysis,TFA)，建立了一種適合于GC-MS數據的ACPD方法。以標準質譜庫中某一組分的質譜為目標因子，利用算法判斷色譜信號中是否存在該組分信息，利用目標因子與該方法計算得到的質譜之間的相似性作為判斷該組分是否存在的依據。所建立方法成功實現了蔬菜中農殘等復雜GC-MS信號的ACPD分析。此外，本課題組[19]基于迭代目標轉換因子分析(Iterative target transformation factor analysis,ITTFA)，提出了一種GC-MS的ACPD算法。該方法同樣以標準質譜庫中某一組分的質譜作為初始向量，沿著色譜洗脫時間采用ITTFA逐一檢驗，以迭代得到的質譜與質譜庫中質譜的匹配度作為判斷該物質是否存在的依據，從而確定復雜色譜信號中所包含的組分信息。利用所建立的方法，實現了河水樣品中16種鄰苯二甲酸酯類物質的ACPD分析。TFA和ITTFA均可用于識別色譜信號中是否存在目標組分信息，但不適用于共存組分較多的大數據矩陣的分析。因此，本課題組又提出了“移動窗口目標轉換因子分析(Moving window target transformation factor analysis,MWTTFA)”方法[20]，沿GC-MS數據矩陣的保留時間方向逐步識別目標組分，不僅可用于判斷目標組分是否存在，還可直接得到目標組分的洗脫時間區間。在解析結果中濃度為零的組分即為不存在的組分，而對于存在的組分則可以得到相應的色譜信息。所建立的方法在復雜農藥混合物色譜信號ACPD分析中得到了成功應用。

2 背景以及基線漂移校正研究新進展

通過ACPD可以實現組分數以及待測組分洗脫時間的確定，但復雜色譜信號中背景以及基線漂移嚴重影響了后續的色譜自動化分析，需對其進行校正。近年來，越來越多的化學計量學方法被用于BDC分析。這些方法主要可分為三類。第一類是基于多項式擬合的方法，但簡單的多項式擬合方法效率低，且解析結果的準確性受操作者經驗的影響。改進型多項式擬合方法在解析結果的準確性和自動化程度上有所提高，但是遇到復雜的色譜信號解析時，這些方法依舊無法實現理想的BDC解析。第二類是基于小波變換的方法，由于背景和基線信號具有較低的頻率，因此在小波空間上扣除較低頻率的背景信息可以實現BDC分析。Liu等[21]提出了一種基于提升方案和最小均方算法的自適應小波變換并將該小波變換用于色譜信號的背景校正。先使用LMS算法生成自適應提升小波的濾波器，再使用提升方案計算信號的細節和近似系數，從而根據頻率高低將信號分解成不同的部分。由于不同部分之間頻率的差異，背景信號可以很容易地被識別和移除。此外，在背景移除的過程中，通過加入“回饋操作”來保證信號不會被“過扣除”。該方法的優勢在于可以在不事先選擇小波函數的情況下根據處理目的和信號本身的特點產生自適應的提升小波濾波器，從而省去了傳統小波變換對信號進行分解時選擇小波函數這一繁瑣而復雜的工作，大大減少了工作量。該算法已成功用于農藥混合物色譜信號的BDC分析，但該方法進行小波變換比較耗時，且需對特殊峰區間和重疊峰等進行特殊處理，算法參數多，因此較難實現自動化的BDC分析。第三類是基于懲罰最小二乘的BDC算法。在對較為復雜的色譜信號BDC處理時，這些算法無法正確識別譜峰位置，易導致最終結果中負值的產生。為了改進傳統方法參數多和效率低的缺點，并實現自動BDC分析，Zhang等[22]提出了一種自適應迭代懲罰最小二乘(Adaptive iteratively reweighted penalized least squares,airPLS)方法，僅通過1個參數即可實現快速自動化的BDC分析。采用參數λ調節擬合背景平滑程度，采用迭代逐步削弱峰對背景擬合的影響，通過引入稀疏矩陣算法將其時間和空間復雜度變為線性，從而可用于更加復雜色譜數據的BDC分析。該方法已成為BDC分析中最常用的方法之一。Baek等[23]在airPLS方法基礎上，基于廣義Logistic函數，提出了非對稱加權懲罰最小二乘(Asymmetrically reweighted penalized least squares,arPLS)方法。與airPLS的對比結果表明該方法提高了對于復雜色譜信號BDC分析的準確性。此外，Liu等[24-25]發現在數據平滑或基線校正時利用稀疏矩陣算法能使矩陣的運算速度大大提升，并通過結合雙邊指數平滑算法和分位數回歸算法，采用迭代加權的策略，提出了選擇性加權分位數回歸算法和自動雙邊指數平滑算法。前者以處理數據的穩健性見長，而后者以處理數據的快速高效性突出。采用這兩種方法均可以實現色譜信號快速準確的BDC分析。

此外，由于ACPD處理中往往需要對色譜信號進行BDC計算，對色譜的BDC處理也促進了ACPD分析。因此目前的研究通常將色譜數據自動化分析的前兩個階段(ACPD和BDC)聯合解決。Yu等[11-12]提出了ACPD-BDC算法，可以實現從復雜色譜數據中自動提取組分信息并消除背景和基線的干擾；Fu等[26]提出了局部最小值穩健統計分析方法(Local minimum values-robust statistical analysis,LMV-RSA)，首先找到信號中的局部最小值，然后基于穩健統計方法采用迭代優化的方式去除屬于組分信息的局部最小值，最后采用線性插值的方式扣除信號中的背景信號。該方法成功提取了GC和GC-MS信號中的色譜信息，如色譜峰的保留時間、峰面積、峰高以及起始位置。Torres-Lapasiód等[27-28]提出了一種新型的ACPD算法和去卷積方法，通過指定閾值的方式來區分信號與噪聲，首先根據一階導數對信號進行分區，再根據二階導數實現對色譜峰的自動識別；針對GC-MS數據的分析，Brereton等[29-30]發展了一種針對大批量GC-MS數據的自動峰值檢測和匹配的算法，在一定程度上解決了色譜數據自動化分析的問題。

3 譜峰漂移校正研究新進展

在實驗操作中，儀器漂移、固定相分解、分析物互相反應等不可控因素，導致不同檢測物中同一物質的色譜峰洗脫時間不同，給定性定量分析造成了一定的困難。譜峰漂移校正是將有差別的色譜中同一物質的譜峰校正至相等的矩陣列中。在譜峰漂移校正方面已提出了許多算法。

第一類是基于一維數據的優化算法，主要有動態規整、峰檢測和進化算法等。但是對于復雜的色譜峰，如信號中不同組分信號強度的差別較大且重疊嚴重等，這些方法無法實現有效的譜峰漂移校正[31]。為此，Zhang等提出了alignDE(Alignment of chromatograms by differential evolution)算法[32]和多尺度譜峰對齊法(Multiscale peak alignment,MSPA)算法[33]。前者采用微分進化算法優化譜峰位置，從而實現譜峰漂移校正，而后者采用連續小波變換確定每個色譜峰的起始位置，將待測信號中的色譜峰按大小順序依次進行譜峰漂移校正。Savorani等[34-35]開發了icoshift(Interval correlation optimised shifting)工具包，可以實現色譜信號的譜峰漂移校正。Li等[36]基于色譜中的共有峰實現譜峰漂移校正，提出了最長距離移動(Longest distance shifting,LDS)方法。與相關最優化規整(Correlation optimized warping,COW)和icoshift方法相比，該方法計算過程簡單，可以實現較為復雜的色譜信號(如重疊峰等譜峰)漂移的校正。Christin等[37-38]將傳統的一維優化函數轉為多通道下函數優化，提出將組分偵測方法與變形方法相結合的色譜時間校正策略(Correlation optimized warping coupled to component detention algorithm,DTW-CODA)。Zheng等[39]基于多尺度高斯平滑，建立了自動時間漂移校正(Automatic time shift alignment,ATSA)方法。該方法包括ACPD-BDC、自適應的初步校正和精準校正3個部分。通過對復雜模擬數據以及實際數據的分析,ATSA處理后數據之間的相關性得到了顯著提高，表明該方法可以實現復雜色譜數據的譜峰漂移校正。

第二類是基于二維數據的算法，現階段具有代表性的方法有基于ITTFA[40]、秩最小化的時間漂移校正法(Rank minimization,RM)[41]及基于平行因子分析(Parallel factor analysis,PARAFAC)[42-43]等建立的譜峰漂移校正方法。其中，ITTFA策略不同于RM和PARAFAC策略，前者是先分解后對比，分解單樣本得到其組分的色譜峰，對比同種組分的不同樣本的譜峰位置差異，后者側重于最小擬合殘差的求取以實現譜峰漂移校正。因此ITTFA算法的準確性取決于算法對單樣本的解析結果，而RM和PARAFAC方法基于譜峰漂移校正轉換為尋找數據最佳擬合，并未構建與譜峰漂移直接相關的目標函數，因此這些方法在解析較為復雜的色譜數據時有可能存在一定的問題。為此，Yu等[31]提出基于樣本間抽象子空間差異度(Abstract subspace difference,ASSD)的譜峰漂移校正方法。該方法的基本思想是色譜時間譜峰漂移可以在抽象子空間中反映出來，從而可以利用兩樣本間的抽象色譜子空間差異實現譜峰漂移的校正。此外，Zheng等[44-45]采用快速傅立葉交叉相關和質譜信息以實現譜峰漂移的校正。首先采用連續小波變換得到譜峰的洗脫區域和峰寬信息，利用快速傅立葉變換交叉相關計算得到每一段保留時間區域的候選移動點數；然后與參考峰對應的質譜進行匹配，確定每一段候選峰的最佳移動點數；最后對無信號區間進行線性插值和譜峰移動以實現最準確的譜峰漂移校正。該方法可用于聯用儀器如GC-MS和LC-MS數據的譜峰漂移校正。此外，Zheng等[46]又利用色譜組分逐步流出的特性以及譜峰漂移的局部相似性進行譜峰漂移校正。通過加入移動窗口的方式，計算每個窗口交叉相關來估計待校準信號需移動的點數，可用于高通量色譜峰漂移的校正。

4 重疊色譜峰解析研究新進展

現已建立了各種重疊色譜峰解析的方法，大多算法都采用固定的“窗口”通過將原始數據分割成包含有色譜峰的小段數據，再利用算法實現對色譜峰的自動化檢測。基于化學因子分析的窗口因子分析方法(Window factor analysis,WFA)是一種應用非常廣泛的信號解析方法。WFA方法的關鍵是找到目標組分濃度分布的區域，這個連續的區域被稱為目標組分的“窗口”。但在傳統的WFA方法中，“窗口”的確定通過檢查所有可能的“窗口”再加上合適的判據來實現，這種方式非常繁瑣和費時。此外，復雜實際樣品的信號常受到背景和譜峰重疊的干擾，使得“窗口”的確定尤為困難。這些問題限制了WFA方法在色譜信號自動化分析中的應用。為了解決這個問題，本課題組[5]發展了一種廣義的“窗口”，提出了廣義窗口因子分析算法(Generalized window factor analysis,GWFA)，用于實際復雜樣品GC-MS信號的快速解析。該方法具有以下優勢：“窗口”確定簡單準確，因而避免了傳統WFA方法中因“窗口”確定不準確時定量結果出現偏差的弊端；由于該方法基于質譜方向建立“窗口”，因而消除了色譜譜峰偏移所帶來的影響；該方法不易受到信號中較大噪聲的干擾。但是該算法需將色譜信號進行分段處理以縮小計算，因此無法完全實現對色譜信號的自動化分析。

實際樣品復雜且基質干擾嚴重，利用GC-MS進行分析時譜峰重疊現象難以避免且信號較為復雜，給信號解析提出了極大的挑戰。針對多組分重疊色譜信號的自動化解析問題，Shao等[19-20]提出了一種基于曲線擬合的免疫算法。通過實驗或計量學提取得到標準信號，免疫算法已成功應用于混合樣品重疊色譜信號的解析中。既往研究中建立的免疫算法通常只適用于少量組分構成的數據，計算之前必須將數據分段，以減小算法應用的難度，因而很難稱為真正的自動高通量分析。而Wu等[47]結合獨立成分分析、ITTFA和非負免疫算法，提出了一種基于多步篩選過程的真正的高通量分析計量學方法。首先，通過獨立成分分析和ITTFA來提取重疊GC-MS信號中所有可能存在的質譜信息；然后以質譜之間的匹配率作為判斷依據，對獲得的質譜數據進行第二次篩選，排除重復信息；最后利用經過前兩步篩選得到的質譜，通過非負免疫算法計算得到相應的色譜數據，通過計算信噪比，對得到的色譜信號進行最后一次篩選，最終將重疊GC-MS信號中所有存在的組分提取出來。以40種農藥混合物的GC-MS信號進行驗證，表明該方法可以一次性地將40種農藥的質譜和色譜信息提取出來，實現了對重疊GC-MS信號的自動化高通量解析。此外，本課題組[20]結合MWTTFA和非負免疫算法，建立了一種高通量解析方法。利用MWTTFA檢驗復雜信號中存在的組分，確定目標組分的質譜信息和洗脫時間的區間，然后以得到的質譜信息作為后續計算的輸入值，利用非負免疫算法解析得到相應的色譜信息。采用快速升溫程序對17種和42種農藥混合標準樣品的GC-MS信號進行分析，利用所建立的方法可在10 min內得到全部組分的色譜和質譜信息，實現快速自動化分析。

近年來，隨著各類新型高階量分析儀器，如全二維液相色譜光二極管陣列聯用儀、全二維液相色譜質譜聯用儀的發展，獲取包含大量化學信息的高維數據已變得較為容易，而傳統的數據處理方法難以實現對復雜高維數據的自動分析。因此，研究者們基于PARAFAC算法建立了一系列的自動解析算法[48-50]。通過將原始數據分割成包含有色譜峰的小段數據，采用非常少的參數，利用PARAFAC算法即可實現對色譜峰的自動化檢測。利用一臺普通的筆記本計算機，采用默認的參數即可在10 min內實現包含有30種多環芳烴的復雜樣品GC-MS信號的快速解析。此外，Yu等[31]結合ASSD 和交替三線性分解(Alternating trilinear decomposition,ATLD)算法,能夠在干擾存在下準確校正出分析物的時間漂移并獲得“二階優勢”。Wu等[51-54]將ATLD方法引入復雜HPLC/DAD和LC-MS信號的自動化解析中，采用“數學分離”對復雜的重疊數據進行解析。結果表明，即使在色譜峰嚴重重疊的情況下，利用該方法亦可以實現對復雜體系中特定多組分的同時定性定量分析，快速解析得到目標分析物的色譜、光譜、質譜和濃度信息，具有獨特的“二階或高階優勢”。

5 前景與展望

色譜數據自動化分析程序的四個部分中，目前的研究大多僅集中解決了其中一個或兩個部分，且主要集中在前兩個階段，即ACPD和BDC，而對后兩個階段——色譜譜峰漂移校正以及重疊色譜峰解析的研究較少。因此，這些方法在一定程度上解決了色譜數據自動化分析的問題，但往往需將原始數據分割成包含有色譜峰的小段數據，不適合大規模數據的自動化分析；同時，對于復雜的食品樣品分析，往往不能得到正確的解析結果。此外，新型高階量分析儀器如全二維液相色譜光二極管陣列聯用儀可以提供四維或更高階的色譜數據。這些數據包含更豐富的分析信息，能避免背景干擾和基體效應，且不易受外界條件的影響，進而提高了預測精度。如何進一步快速有效地提取這些新型儀器提供的復雜色譜信號的信息，并以化學計量學為指導，通過自動化及計算機技術以實現現代分析儀器的智能化功能將成為今后的重點發展方向。

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