超高效液相色譜-串聯質譜法檢測蔬菜中除蟲菊素殘留

李凌云，許曉敏，林 桓，錢 洪，黃曉冬，劉廣洋，鄭姝寧，徐東輝*，裴志國

(1.中國農業科學院蔬菜花卉研究所 農業部蔬菜質量安全控制重點實驗室 農業部園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，北京 100081；2.中國科學院生態環境研究中心 環境化學與生態毒理學國家重點實驗室，北京 100085)

除蟲菊素是從除蟲菊中提取出的植物源性農藥，具有高效、廣譜、低毒、不易產生抗性等特點，因此被廣泛應用于衛生殺蟲領域[1-2]。除蟲菊素由6個結構極相似的化合物組成[3]，即除蟲菊素Ⅰ(Pyrethrin Ⅰ)、除蟲菊素Ⅱ(Pyrethrin Ⅱ)、瓜葉菊素Ⅰ(Cinerin Ⅰ)、瓜葉菊素Ⅱ(Cinerin Ⅱ)、茉酮菊素Ⅰ(Jasmolin Ⅰ)和茉酮菊素Ⅱ(Jasmolin Ⅱ)。其中除蟲菊素Ⅰ和除蟲菊素Ⅱ的含量最高，其它4種化合物的含量相對較低。

除蟲菊素的殘留問題正逐漸引起重視。如我國新版的《食品中農藥最大殘留限量》GB2763-2016中新增了除蟲菊素的殘留限量，規定大白菜中除蟲菊素的最大殘留限量為1.0 mg/kg。但該標準并未給出可以依據或參照的檢測方法。另外該標準規定除蟲菊素的殘留量以除蟲菊素Ⅰ和除蟲菊素Ⅱ之和計算。然而除蟲菊素包括6個組分，對每個組分進行快速準確的定性定量分析，對于真實反映除蟲菊素的殘留現狀，確保人們的食品安全非常重要。

目前報道的除蟲菊素殘留檢測方法有液相色譜法[4]、氣相色譜-質譜聯用法[5-6]和液相色譜-串聯質譜法[7-12]，基質主要涉及土壤[7]、茶葉[8]、嬰兒食品[9]、食品[5,10-12]等。而采用液相色譜-串聯質譜檢測蔬菜中除蟲菊素殘留的研究較少。雖然有些多殘留檢測對象中包括除蟲菊素，但僅涉及除蟲菊素的某個成分，并不能滿足檢測需要。如國標GB/T 20769-2008《水果和蔬菜中450種農藥及相關化學品殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》中包括除蟲菊素，但只有除蟲菊素Ⅰ，未包括其他5個組分。

液相色譜-三重四極桿串聯質譜技術(HPLC-MS/MS)具有分離效果好、靈敏度高、抗干擾能力強、選擇性好等優點，目前已成為農殘檢測的首選方法[13-15]。本研究利用液相色譜-串聯質譜技術，建立了蔬菜樣品中除蟲菊素6個組分的快速檢測方法。蔬菜樣品經乙腈提取，提取液無需凈化，過濾膜后直接上機測定。該方法簡單、快速、回收率高，適用于大批量蔬菜樣品的篩查檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-30A超高效液相色譜儀和LC-MS/MS-8050三重四極桿質譜儀均購自日本Shimadzu公司。

乙腈、甲醇(HPLC級，美國JT Baker公司)；乙酸銨(HPLC級，美國Fluka公司)；甲酸(HPLC級，Dikma科技)；純凈水(Milli-Q超純水儀制備)；除蟲菊素標準品(德國Dr.Ehrenstorfer公司)中各成分含量為：除蟲菊素Ⅰ(51.7%)、除蟲菊素Ⅱ(33.7%)、瓜葉菊素Ⅰ(4.8%)、瓜葉菊素Ⅱ(4.7%)、茉酮菊素Ⅰ(2.9%)、茉酮菊素Ⅱ(1.8%)；其他試劑均為分析純，購自北京化學試劑公司。

1.2 樣品處理

稱取10.0 g蔬菜試樣于50.0 mL離心管中，加入20.0 mL乙腈，振蕩提取30.0 min后，加入5.0 g氯化鈉，劇烈振蕩1.0 min，以5 000 r/min離心3.0 min后，取上層乙腈相，過0.22 μm濾膜,濾液待測。

1.3 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH HSS C18(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)；流動相：A為乙腈；B為0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫條件：0～10 min，60%～80%A；10～10.1 min，80%～100%A；10.1 ～15 min，100%A；15～15.1 min，100%～60%A；15.1～20 min，60%A；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：1 μL。

1.4 質譜條件

ESI離子源；接口電壓4 000 V；正離子掃描；MRM監測模式；霧化氣(氮氣)流速3 L/min，干燥氣(氮氣)流速10 L/min，加熱氣(空氣)流速10 L/min；接口溫度300 ℃；脫溶劑管溫度250 ℃；加熱模塊溫度400 ℃；碰撞氣(氬氣)壓力2.7×105Pa。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

將除蟲菊素配制成100 μg/L的標準溶液。優化質譜參數時，將除蟲菊素標準溶液在不接色譜柱的情況下直接通過液相色譜注入質譜。以甲醇-水(50∶50，體積比)為流動相時，只能得到除蟲菊素Ⅰ和除蟲菊素Ⅱ的[M+H]+離子，分別為m/z329.2和373.2，瓜葉菊素Ⅰ、瓜葉菊素Ⅱ、茉酮菊素Ⅰ、茉酮菊素Ⅱ 的母離子不易找到。而以乙腈-水(50∶50)為流動相時，這4個化合物的母離子分別為m/z317.2、361.2、331.2和375.2，且碎片離子相對穩定。在得到6個化合物的母離子[M+H]+后，利用儀器自動優化功能，篩選二級碎片離子，獲得碎片離子信息及質譜參數Q1(Quadrupole 1)、Q3(Quadrupole3)和碰撞能量(CE)。優化后的質譜參數見表1。

另外，由于除蟲菊素Ⅰ和除蟲菊素Ⅱ，瓜葉菊素Ⅰ和瓜葉菊素Ⅱ，茉酮菊素Ⅰ和茉酮菊素Ⅱ每對化合物的結構非常相似，因此它們具有相同的碎片離子。例如除蟲菊素Ⅰ和Ⅱ具有相同的碎片離子m/z161和133，瓜葉菊素Ⅰ和Ⅱ的碎片離子為m/z107和77，而茉酮菊素Ⅰ和Ⅱ的碎片離子為m/z163和107。

2.2 流動相的優化

如上所述，相比甲醇-水流動相，6個除蟲菊素在乙腈-水作為流動相時的質譜響應更好。因此本實驗采用乙腈作為流動相中的有機相。另外考察了在水相中分別添加0.1%甲酸、1.0 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸-1.0 mmol/L乙酸銨對色譜分離及靈敏度的影響，發現3種添加劑對除蟲菊素的色譜峰形及分離的影響差別不大，但添加少量的甲酸后，各化合物的離子化效率更高，靈敏度更好，且添加甲酸的效果好于添加乙酸銨。因此本實驗最終采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

圖1 大白菜空白基質中除蟲菊素標準溶液的MRM總離子流圖(0.1 mg/L)Fig.1 Total ion chromatogram of China cabbage blank matrix spiked with pyrethrins standard solution at 0.1 mg/L in MRM mode1.cinerin Ⅱ;2.pyrethrin Ⅱ;3.jasmolin Ⅱ;4.cinerinⅠ;5.pyrethrinⅠ;6.jasmolinⅠ

在色譜分離時，瓜葉菊素Ⅰ和除蟲菊素Ⅰ，瓜葉菊素Ⅱ和除蟲菊素Ⅱ的分離比較困難。為此本實驗對梯度洗脫條件進行了優化，最終使6個化合物得到完全分離(圖1)。6種化合物的保留時間分別為4.110、4.297、5.280、7.488、7.676、9.083 min。

2.3 提取方式的優化

本實驗考察了振蕩器振蕩、均質和超聲3種提取方式對除蟲菊素提取效率的影響。結果表明，3種提取方式對6種除蟲菊素的回收率影響差別不大，回收率分別為91.0%～101.8%、94.3%～104.5%、93.4%～102.4%。由于振蕩提取可批量處理樣品，節省實驗時間，因此本實驗采用振蕩器振蕩提取。

2.4 提取溶劑的選擇

本實驗分別比較了提取溶劑丙酮、乙酸乙酯、正己烷和乙腈對6種除蟲菊素回收率的影響。結果顯示，丙酮和乙腈的提取率優于正己烷和乙酸乙酯。以正己烷提取時，6種化合物的回收率為47.4%～103.7%，瓜葉菊素Ⅰ、除蟲菊素Ⅰ、茉酮菊素Ⅰ的回收率較低，分別為66.7%、59.1%和47.4%。以乙酸乙酯提取時，6種化合物的回收率為57.3%～81.4%，瓜葉菊素 Ⅱ、除蟲菊素Ⅱ、茉酮菊素 Ⅱ的回收率較低，分別為63.3%、63.3%和57.3%。而以丙酮和乙腈提取時，6種化合物的回收率分別為69.8%～97.6%和86.2%～99.5%。相比較而言，乙腈提取得到的結果最好，因此本實驗最終選擇乙腈作為提取溶劑。

圖2 除蟲菊素在蔬菜中的基質效應(0.1 mg/L )Fig.2 Matrix effects of pyrethrins at 0.1 mg/L in vegetable matrices

2.5 基質效應考察

基質效應是指基質中的共提取干擾物質影響目標化合物的離子化，從而使目標化合物在儀器上的響應發生增強或抑制的現象。因此在進行農殘測定時，對目標化合物在不同基質中的基質效應進行評價是非常重要的。本文采用較為常用的相對響應值法評價基質效應，基質效應=(B/A-1)×100%[16]，A為純溶劑中化合物的響應值，B為蔬菜基質中添加相同濃度農藥的響應值。實驗考察了0.05、0.1、0.5 mg/L 3個水平下6種化合物在番茄、黃瓜、甘藍、大白菜、菠菜和油菜6種蔬菜基質中的基質效應。結果表明，0.05 mg/L水平下，基質效應為-11.2%～13.0%；0.1 mg/L水平下，基質效應為-4.1%～12.6%；0.5 mg/L水平下，基質效應為-8.5%～6.0%。3個水平下，6種化合物基質效應的絕對值均小于15%，屬于弱基質效應，對測定結果影響較小。圖2為除蟲菊素在蔬菜中0.1 mg/L水平的基質效應。

2.6 方法的線性關系與定量下限

用菠菜、油菜、甘藍、番茄、黃瓜和大白菜6種空白基質溶液，準確配制1.0、5.0、10、25、50、100、250、500、1 000 μg/L的系列混合標準工作溶液，按優化實驗條件進行LC-MS/MS測定。以峰面積(y)對相應質量濃度(x,μg/L)作標準曲線，得到6種農藥的線性方程，各農藥的線性范圍及相關系數見表1。所有農藥的相關系數(r)為0.999 5～0.999 9。其中除蟲菊素Ⅰ和除蟲菊素Ⅱ的線性范圍為1～1 000 μg/L，瓜葉菊素Ⅰ、瓜葉菊素Ⅱ、茉酮菊素Ⅰ和茉酮菊素Ⅱ的線性范圍為10～1 000 μg/L。

表1 6種化合物的保留時間、MRM離子對、碰撞能量、線性范圍、相關系數與定量下限(LOQs)Table 1 Retention times(tR),MRM transitions,collision energies,linear ranges,correlation coefficients and LOQs of six compounds

* quantitative ions

定量下限(LOQ)采用加標回收進行驗證，符合一定的準確度和精密度要求的最低加標濃度，確定為定量下限，定量下限是指除蟲菊素總量。表1結果顯示，除蟲菊素Ⅰ和除蟲菊素Ⅱ的LOQ為0.01 mg/kg，其他4種化合物的LOQ為0.05 mg/kg。除蟲菊素的LOQ低于GB 2763-2016最大殘留限量要求。

2.7 方法的回收率與精密度

本文采用基質匹配標準溶液外標法定量。在菠菜、油菜、甘藍、番茄、黃瓜和大白菜6種基質中對除蟲菊素進行加標回收率實驗，加標水平為0.05、0.1、0.5 mg/kg，每個加標水平重復6次。結果如表2所示，6種物質的平均回收率為73.9%～109.3%，相對標準偏差(RSD)為0.4%～7.7%。方法的準確度和精密度均符合殘留分析的要求。另外，由于除蟲菊素Ⅰ和除蟲菊素Ⅱ的LOQ為0.01 mg/kg，比其它4種化合物的LOQ(0.05 mg/kg)低，因此還對除蟲菊素Ⅰ和除蟲菊素Ⅱ進行了0.01 mg/kg添加水平的回收率實驗，結果見表2。

表2 方法加標回收率和精密度(n=6)Table 2 Spiked recoveries and precisions of the method(n=6)

(續表2)

VegetableSpiked(mg/kg)Recovery(RSD)/%CinerinⅡPyrethrinⅡJasmolinⅡCinerinⅠPyrethrinⅠJasmolinⅠ0.193.9(4.9)90.3(1.1)92.9(4.4)91.1(2.8)93.5(0.5)94.6(2.5)0.591.0(1.2)91.0(0.6)90.7(1.6)92.8(2.5)91.0(0.4)91.1(1.2)Cabbage0.0194.9(6.4)100.1(5.5)0.0599.1(4.8)98.0(1.8)84.5(4.5)91.1(4.5)96.6(0.6)95.6(4.5)0.192.5(3.1)92.9(1.7)83.7(7.0)87.9(4.8)89.6(1.3)78.9(1.1)0.594.2(2.7)92.5(1.4)94.6(3.9)91.2(1.2)91.4(1.2)91.7(0.8)Tomato0.0197.2(3.6)101.8(2.9)0.0596.0(4.5)95.2(3.0)84.4(3.0)92.6(2.0)90.6(2.1)88.9(5.2)0.188.9(5.3)90.2(1.7)85.5(3.1)92.6(3.4)88.9(1.9)84.2(2.3)0.590.9(1.0)92.2(1.1)93.3(2.9)92.0(1.1)90.1(0.6)91.2(1.3)Cucumber0.0185.8(5.4)97.4(3.7)0.0595.8(4.4)94.4(1.9)109.3(6.7)93.8(5.1)94.1(0.8)91.8(3.9)0.194.5(3.7)91.9(1.6)92.2(3.6)90.8(3.5)91.1(2.4)89.7(4.4)0.589.7(1.6)92.1(0.9)92.2(2.2)93.2(1.4)92.4(0.6)91.6(1.4)Chinesecabbage0.01102.9(10.9)93.5(4.7)0.0597.7(3.3)98.6(2.4)97.1(4.6)95.9(5.5)98.3(1.3)94.0(4.1)0.192.8(2.4)90.6(0.9)90.4(5.4)91.5(3.6)91.8(1.3)85.7(5.5)0.594.1(1.2)94.5(0.7)92.8(0.9)97.2(1.1)94.3(0.9)94.3(1.1)

2.8 實際樣品的測定

應用所建立的方法對超市和市場上購買的300個菠菜和油菜樣品進行檢測，結果顯示，樣品中均未檢出除蟲菊素殘留。

3 結 論

本文采用UPLC-MS/MS技術建立了蔬菜中除蟲菊素的快速定性、定量檢測方法。樣品經乙腈提取，鹽析萃取后無需凈化，直接上機分析，縮短了樣品前處理的時間。該方法簡便、快速、靈敏，回收率高，適用于蔬菜樣品中除蟲菊素的快速檢測，并成功應用于實際樣品的測定。

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