豬致病性大腸桿菌的分離及中藥藥敏試驗

徐東方，韓 露

（1.河南省獲嘉縣鄉鎮動物防疫檢疫中心站，河南 獲嘉 453800；2.河南省畜牧總站）

大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的多種動物和人的一組腸道性共患傳染病，是目前養豬業最常見和危害性最大的細菌性疾病之一。它結構比較簡單，容易培養，繁殖能力強，被公認為生物學上重要的實驗材料。由于該病對仔豬危害較大，因此找出最有效的防治方法特別重要，豬大腸桿菌病的傳統治療多用抗生素，但是由于用藥的不規范從而導致部分大腸桿菌對抗生素產生耐藥性。中藥治療該疾病愈來愈受到重視，所以該文對豬致病性大腸桿菌的分離及中藥藥敏進行了試驗，試驗結果表明，中藥治療及預防仔豬大腸桿菌病具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基及實驗儀器

營養肉湯、營養瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美蘭瓊脂、普通營養瓊脂培養基；無菌操作臺，立式高壓蒸汽滅菌鍋，恒溫培養箱。

1.1.2 試劑及實驗動物

大腸桿菌因子，生化試劑以及其他相關用品均購自上海市醫學化驗所試劑廠；實驗所需小白鼠由新鄉醫學院實驗中心提供。

1.1.3 病料

來自河南省輝縣、獲嘉縣等地的大中型豬場中具有很明顯腹瀉癥狀的或者具有黃白痢癥狀的仔豬，用直腸棉拭子蘸取少量的排泄物混懸于裝有1ml營養肉湯的試管中。

1.1.4 受試中藥

大黃、甘草、黃連、胡黃連、元胡、黃薄荷、當歸、杏仁、首烏、獨活、澤瀉、蒼術、丹參、麻黃、梔子、柴胡、枳實等31種中藥。

1.1.5 生化試劑

蔗糖、山梨醇、硫化氫、V-P試劑、尿素、MR試劑、蛋白胨水、枸櫞酸鹽、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、糖類發酵管等均按常規方法制備。

1.2 試驗方法

1.2.1 病豬剖檢及病料采集

對病豬進行剖檢：患病的仔豬具有急性卡他性腸炎癥狀，腸道腫脹，胃內有凝乳塊，腸系膜淋巴結水腫，充血，有彌漫性針尖狀出血。剖開可見腸道內充滿黃綠色液體內容物和氣泡或充滿灰白色醬糊狀內容物和氣泡，散發腥臭味。個別病豬肝臟、腎臟出現小的壞死灶。無菌條件下用直腸棉拭子蘸取少量的病豬的排泄物混懸于盛有10 ml普通營養肉湯的試管中，備用。

1.2.2 病原菌的分離培養與純化

將采集的病料涂片，革蘭氏染色，鏡檢。同時無菌操作將可疑病料接種在伊紅美藍培養基、麥康凱培養基及普通營養培養基上，37℃下恒溫培養24 h后觀察細菌生長及菌落特征。以無菌操作挑單個典型菌落的一半劃線接種于伊紅美藍培養基與麥康凱培養基上37℃下恒溫培養24 h，將另一半菌落涂片，革蘭氏染色，鏡檢;細菌的純化：取初步分離的細菌，在普通培養基上畫線接種后，在37℃下恒溫培養一天，獲得的純培養物放在4℃的低溫環境中保存備用。

1.2.3 生化試驗鑒定

用滅菌環挑取麥康凱瓊脂平板上的形態特征明顯的紅色單菌落，做細菌的微量生化實驗。

1.2.4 致病性試驗

將分離純化后的大腸桿菌，接種于普通肉湯培養物中，搖床37℃培養24 h作為致病性試驗菌液。①注射菌數：每只小白鼠注射0.5 ml。②注射方法：取各種生理標準相似的健康小白鼠15只，分別進行腹腔注射，24 h以后觀察發病情況，剖開觀察病變后進行細菌分離。

1.2.5 細菌的擴大培養

在無菌工作臺中用滅菌的接種環挑取麥康凱瓊脂培養基上單個的粉紅色菌落接種于多個普通瓊脂培養基上，涂滿整個平皿，然后恒溫培養24 h。劃線培養，須涂滿整個平板，隨后進行藥敏試驗。

1.2.6 中藥的煎制

將黃芩、黃連等31種中藥分別按照20 g：200 ml的比例煎藥，每份中藥重20 g，用涼水煎，在水沸前加入藥物，先用大火煮煎到水沸，水沸后再用小火繼續煎45 min。煎制好的藥液要求每毫升含藥物量為1 g，取煎好的藥液用四層紗布過濾裝入滅菌的玻璃瓶（20 ml）中，瓶口壓線，再次高壓蒸汽滅菌，晾涼后備用。

1.2.7 中藥藥敏片的制備

用打孔器將濾紙片制成小圓片（直徑約6 mm），用報紙包好，高壓蒸汽鍋121℃消毒0.5 h。將滅菌濾紙片放入事先準備好的中藥藥液中浸泡45 min，備用。

1.2.8 中藥藥敏試驗方法

將制好的藥敏片無菌貼在涂滿細菌的普通營養瓊脂培養基表面上，每個平皿上按照標準放入四片，紙片間的距離要適當，方便觀察。37℃恒溫培養24 h，觀察結果。

1.2.9 藥敏試驗結果判定

對藥的敏感性通過抑菌圈的大小來判斷。根據參考文獻上的標準，抑菌圈直徑越大表明該藥的敏感性越高。凡是抑菌圈直徑≥10 mm者為強抑菌（敏感），用+++表示；抑菌圈直徑為8～9 mm者為抑菌（中敏），用++表示；抑菌圈直徑≤6 mm者為弱抑菌（耐藥）。

2 結果與分析

2.1 細菌菌落與細菌形態

在麥康凱瓊脂平板上形成了邊緣整齊、直徑2～3 nm中央凹陷、中等大小的粉紅色菌落；伊紅美藍瓊脂平板上形成深紫色、隆凸、表面濕潤、有黑色金屬光澤，直徑約1.5～2.5 nm的菌落。普通培養基中光滑、濕潤、半透明、外觀呈圓形有凸起、顏色灰白的菌落。

2.2 生化試驗鑒定結果與分析

細菌生化試驗結果可得所培養的細菌生化實驗能發酵乳糖、麥芽糖、果糖、甘露醇、葡萄糖、產酸產氣，多數不發酵蔗糖或者少數延遲發酵蔗糖、三糖鐵底部產酸、MR試驗陽性、VP試驗陰性、產生靛基質、尿素酶試驗陰性，實驗結果顯示的特征符合大腸桿菌的特點。

2.3 致病性實驗結果與分析

將分離純化培養的細菌，接種到試驗用小白鼠體內，對24 h后出現病理癥狀的小白鼠進行剖檢，分離病料采集細菌?？傻弥毦旧螒B，生化特征，以及病理變化與接種菌一致，說明接種的大腸桿菌具有致病性。

2.4 藥敏試驗結果與分析

通過藥敏試驗得出，大腸桿菌對薄荷、朱砂、黃連、防風、地榆、王不留敏感；對杏仁、首烏、獨活、石膏、梔子、柴胡、枳實、丹參、麻黃、大黃等中度敏感；對甘草、黃精、連翹、牛膝、胡黃連、元胡、黃黨參、萊菔子、黃芩有一定的耐藥性。

3 討論

從上面的實驗結果，可以找到幾種對仔豬大腸桿菌具有特效的中藥。下面對這幾種高效藥物的作用，進行詳細的表述：①黃連：清熱燥濕，瀉火解毒。黃連內含小蘗堿，它具有廣譜抗菌性，對多種桿菌、球菌、真菌、病毒等都有較強的抑制作用。特別是對菌痢、腹瀉、胃腸炎等癥效果極好。小蘗堿具有良好的消炎、利膽、擴張血管和降低血壓的作用，并且還能增強機體的抵抗力。用于濕熱內蘊、胃腸濕熱、瀉痢等癥，和木香、黃芩等一起合用以治瀉痢。②朱砂：朱砂可以安神，明目，解毒。主要成分為硫化汞，但常夾雜雄黃，瀝青質等有解毒防腐作用。外用能抑制或殺滅皮膚細菌和寄生蟲。清熱解毒效果好，內服、外用均可。③薄荷：俗名“銀丹草”，是中國常用中藥之一。它的活性成分為薄荷油。薄荷油中主要成分為I-薄荷醇、1-薄荷酮及薄荷酯類等。薄荷油是一種常用的藥物。它不僅能促進呼吸道腺體分泌，而且對呼吸道炎癥有治療作用。試驗研究表明，薄荷煎劑對單純性皰疹病毒、流行性腮腺炎病毒有抑制作用，而且對腸炎球菌、炭疽桿菌、白喉桿菌、傷寒桿菌、大腸桿菌等有很好的抑菌作用。

中草藥在防治大腸桿菌病方面的特點和優勢與化學藥物和抗生素相比表現出極大的優勢?；瘜W藥物和抗生素耐藥譜廣，具有毒副作用，甚至能通過肉、蛋傳給人類，中草藥克服了這一難題。可見中草藥可以為人類健康帶來很大的保障。

4 小結

通過對疑似患有大腸桿菌病的仔豬進行臨床觀察，剖檢，并進行實驗室檢查，確定患病仔豬患有大腸桿菌病，并從病料中分離到致病性大腸桿菌，對分離到的細菌進行藥敏試驗，試驗結果表明，黃連對大腸桿菌具有良好的抑菌效果，因此選用黃連作為治療仔豬大腸桿菌病的首選藥物。由于抗生素在治療和預防用藥中容易產生耐藥性，而中藥可以避免機體產生耐藥性，因此選用中藥治療及預防仔豬大腸桿菌病具有重要意義。□