豬細小病毒檢測方法的研究綜述

劉勝利 ，呂玉金 ，李文剛 ＊

（1.河南農業大學牧醫工程學院，河南 鄭州 450002；2.河南牧業經濟學院動物醫學院）

豬細小病毒?。≒PI）是由豬細小病毒引起的母豬繁殖障礙病，主要特征為母豬發生流產、死胎、木乃伊胎及不育、早期胚胎死亡和新生仔豬大量死亡等，也可引起仔豬腹瀉、皮炎及關節炎等。此病發生時，病變主要體現在胎兒，常見的有：胎兒水腫、充血、出血、體腔積液、脫水（木乃伊化）及壞死等病變，而母豬則無明顯臨床癥狀。

隨著行業的發展，養殖規模化、密集型程度越來越高，豬群的跨區域流通機會也越來越多，加快了豬細小病毒病的傳播，且出現了多病混合感染的現象。從1966年首次發現該病分離出病毒后，到目前為止，世界各國均有流行和報道，?，F多種病原混合感染，給養豬業帶來了巨大的經濟損失。目前國內外有多種檢測方式，如血清學檢測、分子生物學檢測等。其中血清學檢測較為常用，但分子生物學檢測更為準確、快速，并可同時檢測多種疾病。

1 傳統的檢測方法

豬細小病毒病可根據其流行病學、臨床癥狀以及剖檢癥狀，做出初步診斷，但確診仍需借助病毒分離、鑒定等實驗室診斷方法。此方法費時費力，而且還需要特定的設備和技術。

在進行病毒的分離與鑒定時，取疑似感染豬細小病毒（PPV）的病料，將病料加雙抗研磨成乳濁液，離心后取上清液，接種于PK-15細胞或ST細胞分離培養。接毒2～3 d后，細胞出現病變，收獲病毒，電鏡觀察。此方法直接、準確、有效，但耗時較長，不能滿足傳染病疫情防治工作的需要，不利于基層單位的使用。

2 血清學檢測方法

2.1 血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗

HA和HI試驗是最簡單、最常用的檢測豬細小病毒的血清學檢測方法。PPV能凝集人、猴、貓、雞、豚鼠、大鼠和小鼠的紅細胞，一般實驗室常用豚鼠紅細胞作為凝集細胞。該方法簡單方便、易行，且能進行快速、大量的樣品檢測，因此應用普遍。HI試驗是檢測抗體的最常用的方法:將待檢血清滅活處理后，用紅細胞吸附，除去血清中的非特異性血凝素，用高嶺土吸附來除去或減少非抗體性抑制因子。該方法較簡便、靈敏度也較高；但所需紅細胞需現用現配，被檢血清的處理也較為繁瑣。

2.2 中和試驗

中和試驗也是常用的檢測PPV抗體的方法。其用PPV與被檢血清的抗體進行中和，根據培養細胞的病變狀況來計算血清抗體的滴度。中和試驗的特異性較高，但操作較復雜，完成一次試驗常需一周或更長的時間，不適于臨床診斷，并且該方法需要水準較高的細胞培養技術和病變結果判定技術等專業技術，一般實驗室不采用。

2.3 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA是一種將抗原抗體免疫反應的特異性和酶的高效催化作用有機結合起來的用于檢測的應用型技術，既可用于檢測抗原，又可用于檢測抗體。Hohdalsu等建立了豬細小病毒的ELISA診斷技術，敏感性顯著高于HI的檢測結果。ELISA檢測方法具有特異性強和敏感度高、操作簡單、檢測快速、高通量等優點，特別適用于基層獸醫部門及大面積疫病普查。田莉莉等建立了檢測豬細小病毒的抗原捕捉ELISA方法（AC-ELISA）用來制備豬細小病毒VP2蛋白單克隆抗體（McAb）。該方法與RT-PCR相比較，符合率較高，有良好的特異性、敏感性和重復性，可應用于豬細小病毒感染的早期診斷。

3 分子生物學檢測方法

3.1 PCR檢測技術

PCR技術是1985年的美國一公司人類遺傳研究室發明的體外擴增特異DNA片段的一種技術。PCR檢測方法是將PCR技術與電泳技術相結合，該方法特異性強、敏感性高、易操作、耗時短，已成為臨床檢測PPV的首選方法（但存在假陽性和PCR污染等弊端）。Moliter等最先報道了PCR在檢測PPV上的應用。

3.2 多重PCR診斷檢測技術

多重PCR診斷方法是普通PCR的改良版，是將多對特異性引物加入同一個PCR反應體系中，對多個DNA模板或同一模板的不同區域擴增多個目的片段的PCR診斷技術。因為多重PCR能夠在一個PCR反應管中同時擴增多個目的片段，因此，既有普通PCR的優點，又能節約大量的時間、人力和物力等，它能快速、準確地診斷疾病，適用于大量臨床樣品（特別是混合感染樣品）中病原體的快速診斷。Huang C等建立了多重PCR技術用于PRV、PPV和PCV的診斷，該法能同時檢測3種病毒的感染。在國內，李文剛、王漢中分別據VP1、VP2序列設計了nest-PCR引物，提高了檢測的特異性和敏感性。

3.3 Taq Man熒光定量PCR檢測方法

隨著熒光定量PCR儀的普及，熒光定量PCR技術飛速發展，它將常規PCR技術與熒光檢測相結合，用來檢測臨床病料中的各種病原。與普通PCR方法相比，熒光定量PCR特異性強、靈敏性高、用時短，而且有相應的分析軟件對數據進行分析、整理，結果更為準確、直觀。另外，實驗過程中只需打開1次試管，有效地減少了假陽性的發生機會，已成為檢測病原體的重要方法。探針法熒光PCR增加了探針結合的反應，進一步提高了其特異性。

3.4 SYBR GreenⅠ實時定量PCR檢測方法

SYBR GreenⅠ是一種具有綠色激發波長的染料，與PCR合成的雙鏈DNA結合后，在激發光照射下能產生熒光，通過熒光強度的檢測，可以實時監測PCR的產物量。SYBR GreenⅠ嵌合熒光簡單，成本較低，并且反應后無需電泳檢測，污染率低、反應時間短、準確性高，且不需要探針，使檢測方法變得簡便，成本較低，能滿足診斷的要求。但熒光染料能和任何雙鏈DNA結合，因此容易產生假陽性信號。

3.5 LAMP檢測方法

環介導等溫擴增技術（LAMP）是一種可高效擴增核酸并廣泛應用于疫病快速檢測的一種新型檢測方法。日本學者Notomi等發明了環介導等溫擴增反應，其針對靶基因設計了2～3對特異引物（內引物、外引物和環引物，其中環引物為非必要引物），在Bst DNA poLymerase等溫條件下作用幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應。LAMP作為一種新的核酸擴增技術，該檢測方法具有特異性強、靈敏度高、操作簡單、反應條件低、反應成本低和設備要求低等優勢，適合用于臨床PPV快速檢測。

3.6 基因芯片檢測技術

基因芯片技術是近年來新興起的一種基因診斷技術，其原理是在固相支持物上原位合成寡核苷酸，或者直接將探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標記的樣品雜交，再檢測分析雜交信號，最終得到樣品的預定結果，基因芯片技術流程中尤以樣品的固定和雜交的檢測最為重要。該技術可以同時檢測多種病毒，同步檢測多個樣品，其具有特異、敏感、快速、高效、可重復、平行化、自動化等特點，節約了疾病診斷時間，因而具有良好的實用性。1995年Schena發表了第一篇關于基因表達芯片的論文，從此以基因芯片為代表的生物芯片技術得到了迅猛發展，在生命科學領域發揮了重要作用。

3.7 可視化基因芯片檢測

可視化芯片技術是在常規芯片基礎上發展起來的一種技術類型，其在基因芯片技術基礎上，將待檢病原體的特異片段作為探針固定在芯片上，用標記有生物素的靶基因與之雜交，再加入納米金標記的鏈霉親和素，最后用硝酸銀和對苯二酚混合液進行銀染從而可以用肉眼或是簡單的光學成像系統捕獲信號。可視化生物芯片具有快速、可視、設備要求低等特點，近些年來被廣泛應用于病原檢測、基因突變檢測及差異表達、酶功能研究等方面，具有巨大的潛在應用前景。

4 結語

綜上所述，豬細小病毒的診斷方法很多，應用最多的是血清學檢測技術，尤其是血凝和血凝抑制試驗，但前者實驗特異性、敏感度較低，在低滴度感染時難于檢出，后者配置血清較麻煩。分子生物學診斷技術中，最常用的是普通PCR技術，但無法一次性檢測多個樣品，而多重PCR檢測，熒光定量檢測，LAMP檢測，基因芯片等方法則具有高度的特異性、靈敏性，可檢測大量樣品，適應于多種病毒混合感染，且檢測結果準確、可靠、快速，尤其是基因芯片技術具有高并行性、高通量的特點，可進行大批量的樣品檢測，但是，其所需的設備體積較大、價格昂貴、實驗室環境要求高，普通實驗室難以開展相關工作?？梢暬蛐酒腔蛐酒夹g的未來走向，它不需昂貴的熒光掃描設備，降低了成本，不受環境局限等，增加了生物芯片的使用范圍，在臨床應用方面將具有更好的發展前景，但目前做不到具備高質量和低價格的可視化基因芯片，因此無法推廣，需打好基礎，做出高質量的基因芯片。以上是各種檢測方法的比較，各有優劣，可根據自身情況優化選擇最適合的檢測方法。□