犬腎臟標記物研究進展

鄺 怡,林嘉寶,夏兆飛

(中國農業大學動物醫學院,北京 海淀 100193)

腎臟損傷或腎功能評估的傳統血液檢查(如血清肌酐和尿素氮)和尿液檢查(如尿蛋白肌酐比和尿比重)被廣泛用于臨床診斷。但由于目前臨床診斷指標的限制性,急需探索更多反映腎小球濾過率(Glomerular Filtration Rate,GFR)和腎小球或腎小管損傷的生物標記物,特別是對腎臟疾病有早期診斷意義的標記物,以便早發現、早治療,提高寵物生活質量。血液標記物易于采集,而腎臟尿液標記物可能有助于定位損傷部位和評估損傷程度。通常而言,高分子量和中分子量尿蛋白反映了腎小球損傷,而低分子量蛋白則反映腎小管損傷。本綜述主要討論這些新型血液和尿液標記物在犬腎臟疾病診斷的研究進展及其限制性。

1 血液標記物

1.1 肌酐 目前動物臨床廣泛應用血清肌酐作為腎臟內源性標記物,但血清肌酐水平顯著升高時,已有3/4腎臟功能受損。一項犬X染色體遺傳性腎病(X-Linked Hereditary Nephropathy,XLHN)研究表明,當GFR平均降低至48%后,血清肌酐才顯著上升[1]。另一項研究表明,當3/4腎臟功能失去時,對應的GFR大約為50%～60%或35%～45%(基于菊粉清除率結果)。所以,當GFR降低至約50%或3/4腎臟功能受損后,血清肌酐才會顯著上升。血清肌酐濃度與GFR的關系呈直角雙曲線關系,即GFR輕度或中度降低時,曲線斜率較小,但當GFR嚴重降低時,曲線斜率變大。

血清肌酐受多種非腎性因素影響,其中最明顯的是肌肉量。此外,大量研究表明,不同年齡、品種和性別等[2-3],都對血清肌酐濃度有不同程度的影響。

當病患肌肉量穩定時,血清肌酐可作為敏感的腎臟功能受損標記物。而當機體狀態不穩定或慢性腎衰后期肌肉量急劇減少時,血清肌酐不是腎臟功能損傷的敏感標記物。因此,血清肌酐對腎臟疾病早期診斷意義不大。

1.2 對稱二甲基精氨酸(Symmetric Dimethylarginine,SDMA) SDMA是各種蛋白精氨酸通過甲基化修飾和蛋白水解作用產物。多個器官組織均可產生,生產速度相對穩定。SDMA不與蛋白結合,可自由濾過腎小球,絕大部分通過腎臟排泄。

SDMA濃度不受肌肉量、體重、炎癥、飲食、品種、體型、性別、年齡(成年)和晝夜變化[4-5]等因素影響。

最近研究表明,SDMA可作為犬GFR內源性替代標記物,特別是對于腎臟疾病患犬。腎臟部分切除模型研究發現,犬SDMA與菊粉清除率相關性強(R=-0.851)[6];XLHN試驗犬研究表明,SDMA與碘海醇清除率相關性極強(R=-0.95),患犬血清SDMA變化比肌酐濃度變化更敏感,平均提前2周。當GFR下降小于≤ 34%時,SDMA已有升高[7]。

總而言之,血清SDMA可作為GFR內源性標記物,特別是對于早期腎臟功能下降的患犬而言。由于SDMA不受體重和肌肉量影響,是伴有肌肉量減少的慢性腎臟疾病患犬理想的腎臟標記物。但其他影響SDMA濃度的非腎性因素還需進一步的研究。

1.3 半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(Cystatin C,CysC)

CysC是一種小分子多肽蛋白酶抑制劑,可自由濾過腎小球,不經腎小管分泌,濾過后幾乎完全被近端腎小管細胞重吸收并分解為氨基酸,機體產生CysC的速率穩定,可作為犬腎臟標記物。

在人醫上,血清CysC已被廣泛應用于腎臟疾病診斷。研究表明,無論在腎臟患者,還是GFR正常的人群中,血清CysC與GFR的相關性、敏感性和陰性預測率都比血清肌酐高[8]。當用血清肌酐濃度無法計算出準確的GFR時,用血清CysC濃度計算公式,可得到更為精準的GFR[9]。血清CysC可作為早期腎臟損傷排查,但對于慢性腎衰晚期,血清CysC無早期診斷優勢[10]。由于尚未有血清CysC的檢測標準,血清CysC作為GFR的補充標記物,但不能替代血清肌酐。

在獸醫領域,對血清CysC的研究近年來逐漸增多。研究表明,血清CysC與GFR的相關性高[11]。犬嚴重急性腎損傷(AKI)時,血清 CysC顯著上升[12]。但由于該試驗沒有GFR數據支持,所以其準確性有待考究。

與健康動物和非腎臟疾病動物相比,犬慢性腎病(CKD)患犬血清CysC顯著升高。健康犬和患非腎臟疾患犬的CysC范圍有部分重疊[11]。但由于大部分試驗沒有GFR數據支持,所以無法排除早期腎損傷的健康犬或非腎臟疾病患犬,其準確性有待考證。一項試驗[11]把CKD患犬分為3組不同程度GFR(菊粉清除率分別為<1.99 mL/min·kg;2.00～2.99 mL/min·kg;≥3 mL/min/kg),結果表明,血清CysC與肌酐和GFR相關性高。與肌酐相比,血清CysC的敏感性(血清CysC:76%;肌酐:65%)高,而特異性稍低(血清CysC:87%;肌酐:91%);血清CysC與肌酐的陽性預測值相似,但血清CysC(69%)的陰性預測值比肌酐(62%)高[13]。碘海醇清除率試驗結果與菊粉清除率試驗結果相似[14]。

血清CysC可能受年齡、體重、運動和性別影響[15],但由于大部分試驗無法確定試驗犬是否完全健康,所以結果有待考證。而其他非腎性因素如糖皮質激素、內分泌疾病和腫瘤等對犬血清CysC影響尚未明確。

犬血清CysC與GFR具有一定相關性,而是否可作為早期診斷標記物和其他非腎性因素是否影響其結果,還需要進一步研究。

2 尿液標記物

尿液腎臟標記物主要為蛋白質,根據分子量大小,蛋白質可分為3種:低分子量(<40 kDa)、中分子量(40～100 kDa)和高分子量(>100 kDa)蛋白質。對于健康動物而言,只有低分子量蛋白質可通過腎小球濾過屏障,并通過腎小管被重吸收回體內。所以,低分子量尿蛋白可作為腎小管損傷標記物,高分子量和中分子量尿蛋白可作為腎小球損傷標記物。理想狀態下,動物機體尿肌酐排泄量恒定,尿液標記物和尿肌酐都是與尿液量成反比例關系。那么尿液標記物/尿肌酐比率的增加或降低,則可反映該尿液標記物分泌的增加或降低。但當患病動物體況不穩定(如AKI和腎移植術后)時,尿液肌酐排泄也隨之變化。所以在AKI中,尿液標記物/尿肌酐的應用仍然存在爭議。

2.1 腎小球損傷或功能紊亂標記物

2.1.1 免疫球蛋白 尿液免疫球蛋白是由脾臟漿細胞、淋巴和骨髓合成的糖蛋白,可分為3類:IgG、IgM和IgA。與犬腎臟疾病相關的免疫球蛋白研究主要有IgG和IgM。

AKI患犬尿液 IgG肌酐比(uIgG/c)、uIgG和uIgA均升高,反映存在有腎小球損傷[16-18]。子宮蓄膿時,uIgG/c升高,術后可恢復到健康水平[19]。暫未有犬AKI尿液IgM變化的相關研究。CKD犬的uIgG變化通常早于尿蛋白肌酐比(Bun/Creatinine Ratio,UPC),并在疾病發展的中后期階段持續上升[20]。uIgM和uIgG與組織損傷相關性高[21]。患免疫介導性腎小球腎炎動物,uIgM和uIgG顯著升高,而非免疫復合物腎小球、腎小球和原發性腎小管疾病動物,升高不明顯,所以uIgM和uIgG可能作為免疫介導性腎小球腎炎的指示性診斷標記物。這些動物的uIgM和uIgG濃度都與存活時間顯著相關[21]。

多項研究表明,膿尿、血尿和細菌尿都會使尿液免疫球蛋白濃度偏高[22-23]。氫化可的松治療超過24周的比格犬,uIgG/c和UPC逐步增加,并隨著治療的停止,逐漸下降[24]。

因此,排除膿尿、血尿、細菌尿和使用糖皮質激素類藥物后,uIgM和uIgG可作為犬腎臟損傷的診斷指標,并對預后有指示性作用,可作為免疫介導性腎小球腎炎的指示性診斷標記物。

2.1.2 白蛋白 白蛋白是由肝臟合成的負急性反應期蛋白,是腎小球、腎小管和腎血管損傷的標記物之一。使用慶大霉素[25-26]、蛇毒、子宮蓄膿[19-20]和腎上腺皮質功能亢進均會導致尿液白蛋白肌酐比(uAlb/c)升高[16,19,24-25]。

2.1.3 C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)

CRP是由肝臟合成的急性反應期蛋白。犬AKI時,尿液CRP肌酐比(uCRP/c)升高[16-19]。子宮蓄膿時,uCRP/c短暫升高、治療后可恢復至正常范圍[19]。健康犬的尿液中無uCRP。

其他腎小球損傷尿液標記物還有犬甲狀腺素運載蛋白(Transthyretin)、脂肪連接蛋白(Adiponectin)和鐵蛋白(Ferritin)等,在此不做詳述。

2.2 腎小管損傷或腎功能紊亂標記物

2.2.1 視黃醇結合蛋白(Retinol-bingding protein,RBP) RBP是一種脂質運載蛋白,主要由肝臟產生。在血液循環中RBP與甲狀腺運載蛋白(Transthyretin,TTR)形成復合物,分子量為54 kDa。單獨RBP可自由通過腎小球濾過屏障,被腎小管上皮細胞重吸收,而RBP與TTR復合物因不能通過健康動物的腎小球濾過屏障,所以RBP可作為腎小球和腎小管損傷標記物。已有犬血漿和尿液RBP的相關研究,市面上,也有犬特異性RBP的ELISA試紙盒,但尚未有其準確性的相關報道。

犬AKI時,尿液RBP(uRBP)和尿液RBP肌酐比(uRBP/c)暫時性升高,提示腎小管功能紊亂[16-18]。子宮蓄膿病例uRBP/c與組織損傷的相關性高,且術后uRBP/c下降明顯[19]。犬CKD時,uRBP、uRBP/c顯著上升。uRBP/c的升高出現在氮質血癥之前、蛋白尿后,且在整個疾病過程中持續升高(基于血清肌酐濃度),而在疾病中期到后期時,顯著升高[20-26]。此外,與其他腎臟標記物相比,uRBP/c與腎小球和組織損傷的相關性最強[20]。蛋白尿對uRBP/c的影響顯著[27]。

uRBP不受尿液采集方式、年齡、膿尿、細菌尿、輕度到中度血尿和血紅蛋白尿影響[20-25]。但明顯血尿樣品的uRBP/c輕微升高[28]。

綜上,uRBP/c不受除蛋白尿以外的其他多種非腎性因素影響,可作為比血清肌酐更早升高的早期腎小管損傷標記物。

2.2.2 嗜中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)NGAL是一種由嗜中性粒細胞和某些上皮細胞如腎小管表達的微量蛋白,可自由通過腎小球濾過屏障。腎臟損傷時,NGAL被釋放至血液和尿液中。受損的腎小管上皮細胞中NGAL合成增加。

兩項獨立的研究表明,犬注射慶大霉素1 d后,uNGAL/c就已升高,且與腎小管損傷嚴重程度相關,uNGAL/c可作為慶大霉素誘導的AKI的敏感且預測性標記物[29]。慶大霉素和多黏菌素B誘導的AKI,其uNGAL/c變化與用藥劑量相關[29]。氮質血癥(無論是 AKI還是 CKD)患犬,其 uNGAL、uNGAL/c和血清NGAL都顯著升高[30]。與AKI相似,CKD犬uNGAL/c的升高出現在CKD早期。有蛋白尿的CKD患犬,uNGAL/c與CKD嚴重程度呈正相關。此外,uNGAL/c與犬腎小球和組織損傷有較強相關性[21]。與健康犬、泌尿道感染和其他下泌尿道疾病患犬相比,CKD患犬uNGAL、uNGAL/c和血清NGAL都顯著升高[31]。AKI患犬的uNGAL/c升高較CKD和下泌尿道疾病患犬更為顯著。此外,非氮質血癥(AKI 1級)患犬,uNGAL/c升高,提示已有腎臟損傷,早于血清肌酐變化[31]。

犬尿液NGAL性狀穩定,不受胃炎、蛋白丟失性腸病、肝病腸炎和門靜脈短路等影響[30]。uNGAL和uNGAL/c都與體重呈正相關關系[32]。無論是否有氮質血癥、膿尿、泌尿道感染和其他下泌尿道疾病(如移形細胞癌和草酸鈣結石)都會明顯影響uNGAL/c和uNGAL檢測結果。

上述可知,uNGAL、uNGAL/c雖然受多種非腎性因素影響,但可作為早期腎損傷(AKI和CKD)的標記物。由于大部分試驗沒有GFR數據支持,所以還需要進一步試驗研究其與GFR的相關性和更多其他非腎性因素對其結果的影響。

其他腎小管損傷或功能紊亂標記物有犬Tamm-Horsfall蛋白、白細胞介素、單核細胞趨化因子-1、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、α1-微球蛋白、β2-微球蛋白和載脂蛋白A1等。

3 結語

隨著人們對犬腎臟標記物的研究越來越深入,至今為止,已發現除肌酐和尿素氮以外的多種犬腎臟標記物。其中,受非腎性因素影響較少的標記物有血清SDMA和uRBP,而對腎臟疾病早期診斷意義的血液標記物有血清SDMA、CysC、尿液免疫球蛋白、uRBP和uNGAL等。此外,對于各種有可能成為有臨床應用腎臟標記物,仍需更深入研究,如大規模的臨床試驗及其臨床應用統計數據和其他非腎性因素對腎臟標記物的影響等。

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