抗菌肽抑菌機理及其研究方法

張 宇，姜 寧，張愛忠

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319）

抗生素產生耐藥性的問題日益嚴重，許多抗生素已經被禁用，抗菌肽作為抗生素的替代品之一，在農業、畜牧業、食品生產和醫藥衛生等領域被廣泛關注。天然的抗菌肽是由生物體內基因編碼并通過核糖體合成的小分子肽，具有廣譜抗菌性且不易使細菌產生耐藥性，其來源十分廣泛，可以分為昆蟲抗菌肽、植物抗菌肽、哺乳動物抗菌肽、兩棲動物抗菌肽、魚類、軟體動物、甲殼類動物抗菌肽、微生物源抗菌肽，其中微生物源抗菌肽容易獲得，但是被開發利用的并不多[1]?？咕牡慕Y構主要有α-螺旋、β-折疊和環狀結構，不同結構的抗菌肽性質特點有所不同[2]。

目前被發現且分離鑒定出結構的抗菌肽已有一千多種，但研究抗菌肽的基本結構只是應用的前提，若要將抗菌肽應用到實際生產，使其真正成為有效的抗生素替代品并充分發揮抑菌效果，發揮應有的作用價值，就必須明確抗菌肽的抑菌機理。同種抗菌肽對于不同的細菌作用部位和機制可能不同，而不同的抗菌肽對于相同細菌的作用也不同。大量的研究表明，抗菌肽的抑菌機制與其來源和結構并沒有絕對的關系,但是卻有相對的相關性[3]。為此，本文對抗菌肽的抑菌機理及其相應的研究方法進行了綜述，以期為抗菌肽的深入研究提供參考。

1 抗菌肽的抑菌機理

1.1抗菌肽作用于細菌細胞壁細胞壁能維持細菌的形狀，是保護菌體的最外層屏障，細胞壁一旦被破壞就會引起細菌細胞結構的變化和細胞死亡?？咕淖饔糜诩毦鷷r最先接觸細胞壁，通過破壞細胞壁的結構發揮抑菌作用[4]。帶正電荷的抗菌肽可以與細胞壁中的脂多糖和磷壁酸相結合。Singh等[5]發現，S1系列抗菌肽與脂多糖的結合程度取決于其所帶電荷的數量及疏水性的強弱，衍生肽GKY25的兩親性與其同脂多糖和磷壁酸的結合呈顯著的線性關系[6]。有研究表明,帶正電荷的抗菌肽會取代細胞壁表面帶負電的Mg2+和Ca2+并導致細胞壁結構發生改變，抗菌肽能穿過細胞壁作用于細菌細胞膜。很多研究表明，抗菌肽對細菌細胞壁的破壞不僅取決于其所帶電荷多少和疏水性強弱，作用于細菌的濃度也會影響抗菌肽對細胞壁的破壞程度。

1.2抗菌肽作用于細菌細胞膜抗菌肽穿過第一道屏障細胞壁后接觸到細菌細胞膜，氨基酸殘基與磷脂雙分子在靜電作用下發生結合?？咕耐ㄟ^將疏水端插入細胞膜的輸水區域來改變膜的結構或使膜蛋白發生凝聚失去活性，進入磷脂雙分子層后親水端發生結合并形成離子通道，細胞內物質外泄導致菌體的死亡，但只有當膜電勢高于110 nv時，離子通道才能開啟或關閉[7]。絕大部分抗菌肽的抑菌模式是通過對細胞膜的破壞作用實現的，但抗菌肽與膜的相互作用會受到肽鏈長度、二級結構、電荷分布情況以及疏水性的影響[8]?？咕膶毎さ木唧w作用機制主要有以下四種假說[9-10]。

1.3抗菌肽入胞后的作用機制有些抗菌肽的殺菌方式并不是或不完全是作用于細菌的細胞壁和細胞膜，它們能穿透細胞壁膜進入細胞內，通過阻斷細菌核酸（DNA、RNA）的合成、影響蛋白質和細胞壁的形成、抑制胞內酶活性發揮殺菌作用。但有些抗菌肽甚至可以通過抑制細胞呼吸等方式來達到抑菌作用，如某些富含脯氨酸的抗菌肽同細菌的熱休克蛋白結合發揮抗菌活性[15]。

1.3.1 抗菌肽對細菌DNA的作用 大量的試驗結果表明，某些種類的抗菌肽可抑制核酸物質的合成。來自于兩棲動物皮膚的抗菌肽Dermaseptin、來自于牛中性粒細胞的抗菌肽Bac5/Bac7和人汗腺中的抗菌肽Dermcidin均能抑制細菌RNA的合成，而人附睪中的HE2和人嗜中性粒細胞中的HNP-1和HNP-2既能抑制RNA又能抑制DNA合成。蘇冠芳等[16]研究發現，buforinⅡ衍生物可以在不破壞菌膜的情況下進入金黃葡萄球菌內與DNA合成基因特異性結合，通過阻止DNA的合成達到抑菌效果。Hao等[17]研究發現buforinⅡ衍生物能插入DNA雙螺旋的凹槽內通過干擾堿基對聚集來影響DNA的復制。陳旋等[18]研究發現，抗菌肽P7能嵌入大腸桿菌DNA堿基形成DNA-肽復合物，與rnhA序列發生特異性結合進而影響大腸桿菌的DNA復制和RNA合成。陳飛龍等[19]研究發現，由副干酪乳桿菌FX-6產生的抗菌肽F1以嵌插的方式與金黃色葡萄球菌的DNA結合，影響細胞分裂周期和遺傳信息的正常表達。

表1 抗菌肽四種作用機制假說Table 1 Four hypothesis mechanisms of antimicrobial peptides

1.3.2 抗菌肽對細胞壁合成的作用 抗菌肽除在胞外能破壞細胞壁結構，還可以在胞內通過抑制細胞壁的合成和阻止細胞的分裂等方式殺滅細菌。很多種類的抗菌肽都可以通過抑制細胞壁的合成來阻止細胞分裂，如來自于麻蠅的Sarcotoxins、變異鏈球菌抗菌肽Mutacin1140和放線菌抗菌肽Planosporicin等[16]。細胞壁的主要成分之一是肽聚糖，研究表明放線菌抗菌肽Planosporicin能阻斷肽聚糖合成導致細菌細胞壁合成受阻。

1.3.3 抗菌肽對酶的作用 部分抗菌肽可以通過抑制細胞內酶的活性影響菌體代謝。陳飛龍等[19]發現，經抗菌肽F1處理后的金黃色葡萄球菌代謝受到影響，抗菌肽F1降低了細胞內非特異性酯酶及β-半乳糖苷酶的活性。某些種類的兩棲動物抗菌肽如aurein 2.2、carein 1.8等，可通過抑制大腸桿菌細胞內ATP生成酶的活性影響其能量代謝，使細菌生長速率下降[20]。劉立偉等[21]發現，抗菌肽能誘發胞內蛋白酶和鈣離子外流，刺激細胞色素C釋放，通過酶促反應使細胞凋亡。

2 抗菌肽抑菌機制的研究方法

對于抗菌肽不同的抑菌機制可采用不同的研究方法。通常采用電鏡技術（透射電鏡、掃描電鏡）和顯微鏡技術（原子力顯微鏡、熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡等）結合熒光染色技術等來觀察抗菌肽對細菌膜的作用；采用SDS電泳、DNA凝膠阻滯、熒光光譜分析、流式細胞技術、蛋白質印記法等方法研究抗菌肽入胞后的作用機制；近年來，通過人工建立生物膜模型和動力學模擬，結合電化學方法、核磁共振技術、熒光淬滅法、圓二色譜法及其他物理學光譜分析法，能更清晰便捷地了解抗菌肽的抗菌機制。

2.1抗菌肽對細菌細胞膜作用機制的研究方法大量的研究表明，細菌外膜是抗菌肽作用的主要部位，通過觀察細菌的外部形態以及胞膜結構的完整性可以確定某種抗菌肽的作用靶點是否在細菌的細胞膜上。電鏡可以觀察到抗菌肽的微觀結構變化：細菌壁或膜表面的變化，其中透射電鏡可以觀察到更加細微的變化，如細菌細胞內外膜發生分離、膜表面出現孔洞、細胞內容物外流等。利用原子力顯微鏡并借助相關的軟件，無需對細菌進行特殊處理即可計算出膜表面產生的孔洞直徑大小。電化學掃描隧道顯微鏡的分辨率較高，可以觀察到分子內單個原子的排列情況。這兩種顯微鏡雖然能夠觀察到極其細微的結構，但在研究中應用較多的是透射電鏡和掃描電鏡。謝海偉等[22]研究合成的鱟素抗菌肽對大腸桿菌等其他細菌的作用，通過電鏡掃描觀察發現細菌細胞的微觀結構發生較大的變化，細胞表面出現坍塌和破裂。魏曉曉等[23]在掃描電鏡下觀察到被改造的牛血紅蛋白源抗菌肽JH-3可以使金黃色葡萄球菌的發生皺縮、使大腸桿菌的細胞膜表面出現孔洞、使白色念珠菌的表面凹凸不平并出現明顯裂痕。劉艷環等[24]通過透射電鏡觀察發現，抗菌肽MSL可以使金黃葡萄球菌和綠膿桿菌的細胞膜破損甚至導致細胞瓦解，胞內染色質發生聚集現象。李瑞芳等[25]在篩選嗜鉻粒蛋白衍生肽時，通過掃描電鏡觀察CGA-N12可以使熱帶念珠菌菌體皺縮出現裂縫；通過透射電鏡觀察，發現其可以使細胞壁與膜之間空隙變窄、顏色變深，細胞器受到破壞。馮興軍等[26]通過透射電鏡掃描發現鴨抗菌肽Cath（1-20）和Cath（5-20）能破壞細菌細胞膜，證明鴨抗菌肽的作用靶點就是細胞膜。Krisztina Nagy等[27]通過原子力顯微鏡觀察富含半胱氨酸的抗菌肽NCR247和NCR335均能使大腸桿菌表面粗糙度增加，引起胞膜損傷，進而得出結論：抗菌肽NCR作用于細菌的第一個靶標可能是細菌細胞膜。

通過電鏡和原子力顯微鏡只能觀察到未經處理的細菌細胞膜表觀形態結構的變化，但是其具體的實質性變化需要通過熒光染色，借助熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡以及流式細胞儀等技術檢測。張倩[28]用PI染色含色氨酸的陽離子抗菌肽，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到被熒光標記的抗菌肽出現在細菌細胞質和細胞核。蘇冠芳等[16]通過熒光光譜分析發現抗菌肽buforinⅡ衍生物與金黃葡萄球菌的DNA結合方式為嵌入式，通過流式細胞儀探究抗菌肽對細菌細胞周期的影響發現buforinⅡ能特異性地阻滯DNA合成階段。Bi等[29]用熒光標記的抗菌肽作用于大腸桿菌后在激光共聚焦顯微鏡下觀察到被感染的細菌出現熒光，通過流式細胞儀對不同光信號采集整合并以散點圖展示出試驗結果。Liu等[30]通過熒光染色和流式細胞技術也發現，在一段時間的作用后DiBAC4染料能進入到90%以上的細菌中。

2.2抗菌肽進入細菌細胞后作用機制的研究方法有些抗菌肽既能作用于細菌細胞膜又能入胞發揮作用，而有些抗菌肽能在不破壞細胞膜的情況下在細胞內找到作用靶點，發揮殺菌作用。SDS電泳、DNA凝膠阻滯、熒光光譜分析、蛋白質印記法等常用來研究抗菌肽入胞之后的作用機制。陳飛龍等[19]通過鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷法、凝膠阻滯電泳、SDS電泳、考馬斯亮藍檢測、熒光染色及流式細胞術等方法探究抗菌肽F1對金黃葡萄球菌的抑菌作用發現，抗菌肽F1以嵌插的方式與細菌的DNA結合，進而影響DNA的復制和蛋白質的表達，細胞內的β-半乳糖苷酶和非特異性酯酶的活性降低，細菌生長代謝受阻。陳旋等[18]研究抗菌肽P7對大腸桿菌的非膜作用方式時，通過P7與染色劑結合大腸桿菌DNA的熒光光譜來分析P7與DNA的結合方式；通過流式細胞技術分析抗菌肽與大腸桿菌DNA結合對細胞周期的影響；通過核酸染色及熒光分析探究P7對大腸桿核酸合成的影響。

2.3人工生物膜的建立及動力學模擬抗菌肽與細菌細胞直接接觸作用并借助其他試驗技術是生物學的驗證和研究，而采用人工模擬合成細胞膜及分子動力學模擬等方法，能進一步清晰地闡明抗菌肽與磷脂雙分子層的作用方式。

人工建立的生物膜模型有很多，可以采用某一種磷脂或幾種磷脂混合構成脂質體，也可采用囊泡模型或者固體支撐膜模型來模擬。一般用磷脂酰膽堿（DMPC）模擬動植物細胞膜；用磷脂酰甘油（DMPG）模擬細菌細胞膜。在建立的模型上通過電化學方法、核磁共振法、圓二色譜法、熒光淬滅法、X-射線結晶學技術、熒光法、拉曼光譜及傅立葉轉換紅外線（FTIR）等研究方法可以測定出抗菌肽與磷脂雙分子的作用方式。在實際的研究中，一般采用上述的某一種方法或幾種方法相結合。冉瑜[31]通過電化學的方法將人工脂質體固定修飾到電極形成雙層膜，通過電流大小得知膜的完整性，同時采用色氨酸淬滅試驗對熒光淬滅，研究脂質體與抗菌肽的作用。圓二色譜法和核磁共振法通常用來檢測抗菌肽與細胞膜作用時的二級結構變化。圓二色譜（CD）應用廣、簡單、快捷，可以測定抗菌肽在不同溶劑中二級結構的變化情況；核磁共振法在進行同位素標記時不破壞樣品的結構，樣品也不需要結晶處理，更接近于內環境，同時，通過固態和液態核磁共振相結合能進一步清楚了解抗菌肽與細胞膜的作用方式。孫宜君[32]通過圓二色譜研究螺旋藻抗菌肽的抑菌機理時發現，在水中抗菌肽以無規則卷曲形式存在，而在疏水條件下則主要以β-折疊形式存在。葉南慧等[33]利用圓二色譜法和核磁共振法測定不同溶液中沼水蛙抗菌肽的二級結構并研究其抑菌機理，結果表明，沼水蛙抗菌肽的二級結構會因溶劑不同而發生變化。而X-射線結晶學、拉曼光譜及傅立葉轉換紅外光譜是通過物理學方法，經射線的散射作用獲得光譜，進一步分析抗菌肽及生物膜的分子結構變化，目前的應用不及其他方法廣泛。Lauren等[34]用和頻振動光譜（SFG）研究抗菌肽不同人工模擬的脂質膜作用時發現，大腸桿菌膜脂質提取物模擬的生物膜要優于純POPG模擬的復合膜。

分子動力學（MD）模擬是多原子系統在外力場的作用下單個原子發生運動，根據運動軌跡和力學統計方法獲得體系的力學量和性質。繼1977年Karplus等對牛蛋白酶抑制劑進行分子動力學模擬之后，分子動力學方法被廣泛應用，隨后又被與計算機模擬相結合，使得分子動力學模擬成為生物大分子研究中重要途徑之一。利用此模擬方法是從原子水平對抗菌肽與細胞膜作用方式的分析，通過微觀角度的觀察來驗證宏觀的試驗猜想，進一步明確抗菌肽的作用機理。毛文超[35]利用分子動力學模擬研究抗菌肽LL-37對人工模擬的細菌及哺乳動物紅細胞細胞膜的作用，通過不同的力場作用，計算并分析出肽和膜的穩定性及形態結構變化等，得到與實際試驗一樣的結論。類似的探究和驗證抗菌肽作用于細胞膜的試驗有很多，蟲孔模型和毯式模型都經過此模擬方法得到驗證[36]。

研究表明，分子動力學（MD）模擬只能研究抗菌肽作用于細胞膜形成的孔隙情況，而不能研究整個過程的作用情況。所以在MD的基礎上衍變出了耗散粒子動力學（DPD）。DPD可以模擬長度為毫米和時間為毫秒的尺度系統，將耗散粒子動力學與靜電相互作用相結合，使研究者在較大的時間和尺度上探究抗菌肽在磷脂雙分子層上易位的全過程。將靜電相互作用結合耗散的粒子動力學模擬探究抗菌肽穿過磷脂雙分子層的方式會發現，只有達到肽濃度臨界值時抗菌肽才會穿過膜，作用方式為先垂直插入再平行吸附。

3 小結

抗菌肽來源廣、種類多，在動植物及微生物體內含量很低，但殺菌作用明顯，可通過對細菌細胞壁、細胞膜和胞內物質的作用發揮作用。但由于抗菌肽種類繁多，結構不同，即使是同類抗菌肽對于不同亞群的細菌抑菌機理也有可能不同。近階段一些研究表明，細菌也會對抗菌肽產生一定程度的耐受性，主要有以下幾種途徑：通過改變自身細胞膜結構和結合位點影響抗菌肽的結合；通過分泌和釋放蛋白降解酶降解抗菌肽；通過改變細胞膜表面的電荷分布，如增加正電荷量減少與抗菌肽的靜電吸引作用；通過某種運輸機制降低抗菌肽在細胞膜表面的濃度；通過基因突變產生對抗菌肽的耐受性；通過被抗菌肽激活的調節通路和特異性原件抵御抗菌肽。為了避免和解決細菌對抗菌肽的耐藥性問題，深入研究不同抗菌肽的抑菌機制是十分重要的，同時這也將成為未來抗菌肽研究領域的一大熱點問題。

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