Klotho基因轉染BMSC移植對慢性心衰大鼠心肌細胞凋亡的影響

王 歡，朱向情，李慧萍，尹 娜，甘世保，楊 靜，李麗娟，潘興華，魏 玲

心肌細胞凋亡是心肌重構的主要病理基礎，它在心衰、心律失常等多種心臟疾病的病理生理中起著重要作用。本課題組前期研究表明，骨髓間充質干細胞（BMSC）在心肌微環境下，能向心肌細胞、浦肯野細胞及內皮細胞分化，并分泌各種細胞因子，抑制心肌細胞凋亡，促進心肌細胞生長，減少基質膠原沉積，減輕心肌纖維化[1]。Klotho基因是1997年Kuro等研究自發性高血壓大鼠時偶然發現的新型抗衰老基因，具有抗氧化應激、減少炎癥反應、抑制心肌細胞及血管內皮細胞凋亡、改善心肌微環境等作用[2]。本研究將重組慢病毒介導的Klotho基因轉染至BMSC，并移植到慢性心衰大鼠心肌中，探討Klotho基因修飾的BMSC移植對慢性心衰大鼠心肌細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠24只，其中 18 只鼠齡約 3 月齡，體重（300±30）g，用于心衰大鼠模型制備，另外6只為正常組；另有6只1月齡大鼠，體重（100±20）g，用于制備 BMSC。所用動物均由昆明醫科大學動物實驗中心提供[動物許可證號：SCXK（滇）2011-0005]。置動物房適應性喂養1 w，自由攝食及飲水，實驗前12 h禁食。

1.2 試劑與儀器 DMEM-F12細胞培養基（北京HyClone 公司），胎牛血清（FBS，美國 BI公司），胰蛋白酶-EDTA消化液、青-鏈霉素抗生素（北京Solarbio公司），SD大鼠BMSC成骨、成脂誘導分化培養基（廣州賽業生物科技有限公司）；鹽酸異丙腎上腺素注射液（上海禾豐制藥有限公司），Masson染色試劑盒（武漢谷歌生物科技有限公司），慢病毒載體LVEGFP-Klotho基因，LV-EGFP基因（上海吉凱生物有限公司）。

1.3 BMSC的分離培養及Klotho基因轉染 取1月齡大鼠，按本課題組另文報道的方法制備、鑒定BMSC。取第 3代 BMSC，以 5×105個細胞/孔鋪板于48孔板，至細胞覆蓋率達70%時，按預先測的最佳感染復數（MOI值）150計算并加入慢病毒LV-EGFP、LVKlotho病毒液，進行慢病毒LV-EGFP-Klotho基因轉染BMSC。取病毒轉染1 w后的BMSC，同時以未轉染BMSC及EGFP-BMSC為對照。用Trizol法提取總RNA，測定RNA濃度，按照反轉錄試劑盒說明書，取1 μg RNA反轉錄獲得cDNA，并以cDNA為模板，擴增目的基因片段。PCR引物由上海生工生物有限公司合成。大鼠Klotho引物：上游CAATGG CTTCCCTCCTTTACCT，下游 TTCTCTTCTTGGCTAC AACCCC，內參GAPDH引物：上游5'TTCCTACCCC CAATGTATCCG3'，下游 5'CATGAGGTCCACCACCC TGTT3'。PCR反應條件為預變性95℃、10 min，再一步變性95℃、15 s，退火延伸60℃、60 s，共40個循環。PCR結束后，根據每個樣本反應后達到熒光信號閾值的循環數（Ct值）計算 2-△△Ct值。

1.4 大鼠心衰模型制備及分組 實驗大鼠腹腔給予異丙腎上腺素注射，3 mg/(kg·d)，共 14 d，建立慢性心衰大鼠模型。隨機將18只慢性心衰模型大鼠分為Klotho-BMSC、BMSC、模型組，同時設正常組，每組6只。Klotho-BMSC組和BMSC組分別經尾靜脈注射攜帶Klotho基因的EGFP基因標記BMSC(EGFP-Klotho-BMSC)和僅EGFP基因標記的BMSC(EGFP-BMSC)5×106個/ml，1 ml/只；模型組經尾靜脈注射等量生理鹽水，正常組不做處理，

1.5 大鼠心肌細胞凋亡檢測 BMSC治療后28 d，取各組大鼠心肌組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、連續切片，切片厚度為 5 μm，進行 TUNEL染色。另取各組大鼠心肌組織標本進行OCT包埋及冰凍切片（15 μm），在倒置熒光顯微鏡下觀察轉染EGFP的BMSC存活及分布情況。

1.6 統計學方法 應用SPSS18.0軟件分析數據，計量資料以均數±標準差表示，多個樣本均數間的比較采用方差分析和LSD-t檢驗；兩變量相關性采用Pearson相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMSC形態觀察 BMSC分離培養48 h后，可見短小梭形、三角形的BMSC貼壁生長；4 d后集落形成，細胞體積增大，多呈長梭形；原代細胞10 d左右達90%以上融合，為均一呈漩渦狀排列的長梭形細胞群。傳代后細胞增殖時間縮短，形態為成纖維樣，平均4 d達85%以上融合。見圖1。

2.2 轉染Klotho后各組Klotho mRNA表達量比較RT-PCR檢測結果顯示，模型組、BMSC組、Klotho-BMSC組的Klotho mRNA相對表達量分別為0.4256±0.4464、0.4185±0.4251 和 1.000±0.7076，Klotho-BMS 組顯著高于其他兩組（P＜0.05）。

2.3 Klotho-BMSC治療4 w后各組心肌組織綠色熒光分布 熒光顯微鏡下可見，Klotho-BMSC組和BMSC組有EGFP標記的BMSC在心肌組織中分布，并且Klotho-BMSC組明顯多于單純BMSC組，而模型組和正常組未見EGFP陽性細胞分布（圖2）。

2.4 各組心肌Klotho mRNA表達水平比較 各組大鼠心肌組織中均有Klotho基因表達（圖3）。正常組、模型組、BMSC組、Klotho-BMSC組心肌組織中Klotho基因的mRNA相對表達量分別為1.803±0.530、0.782±0.145、1.207±0.214、4.857±0.597。 Klotho-BMSC組的Klotho mRNA表達水平較模型組、BMSC組高（P＜0.01），BMSC組與模型組之間無顯著差異（P ＞ 0.05）。

2.5 Klotho-BMSC治療4 w后各組心肌細胞凋亡率比較 正常組心肌細胞凋亡數量很少；腹腔注射ISO后，心肌細胞凋亡率增加，BMSC組為（23.55±3.62）%、Klotho-BMSC 組為（12.61±2.00）%、模型組為（43.61±4.88）%,較正常組（1.53±0.69）%顯著升高（P＜ 0.01）。 而 Klotho-BMSC 組、BMSC 組低于模型（P＜0.01），以Klotho-BMSC組降低最明顯（P＜ 0.01）。

2.6 心肌細胞凋亡率與心肌組織Klotho mRNA的相關性分析 各組心肌組織Klotho mRNA的表達量及心肌細胞凋亡率均呈正態分布。Pearson相關分析結果顯示，心肌Klotho mRNA表達量與心肌細胞凋亡率呈顯著負相關（r=-0.598，P＜0.05）。

3 討論

圖1 BMSC培養形態觀察

心肌細胞凋亡是心肌重構期心肌收縮單元不斷喪失的主要原因[6]。研究顯示，心肌細胞凋亡后，其自我修復能力是極其有限的，不足以彌補心肌細胞數的減少及維持心肌損傷的修復，其對早期及晚期心肌重構乃至心衰的產生和惡化均有促發作用[7]。BMSC具有自我更新及高度增殖能力，能自體移植，能向多種組織分化，并且具有修復受損組織的潛能[3]。王永等[3]研究發現，BMSC移植能改善犬急性心肌梗死后心肌纖維化，其心肌間質膠原含量隨著時間呈減少趨勢。徐燕等[4]研究證明，BMSC能治療擴張型心肌病大鼠，細胞移植4 w后，大鼠心功能明顯改善，心肌膠原含量減少，心肌MMP-2及MMP-9的表達降低，心肌纖維化明顯改善。本研究與上述實驗結果類似，也發現BMSC移植治療慢性心衰大鼠4 w后，大鼠心肌細胞變性壞死程度較模型組明顯減少，提示BMSC具有抗慢性心衰大鼠心肌細胞凋亡的作用。

圖2 EGFP標記的大鼠BMSC在心衰大鼠心肌內的分布情況

圖3 心肌組織中Klotho mRNA表達水平的實時定量PCR檢測結果

Klotho基因具有抑制血管緊張素Ⅱ誘導活性氧族產生、抑制細胞衰老及凋亡、抗炎癥反應、維持內皮細胞完整性、促進NO的產生、改善動脈順應性、改善心肌重構及纖維化等作用[5-6]。本實驗將Klotho基因轉染至EGFP基因標記的BMSC，并成功移植到慢性心衰大鼠心肌中，熒光顯微鏡下可見，Klotho基因修飾后的BMSC在心肌組織中的存活率明顯增加，而心肌細胞凋亡率進一步降低。本研究結果提示，BMSC本身具有抑制心衰大鼠心肌細胞凋亡、纖維化的功能，Klotho基因修飾BMSC移植治療慢性心衰大鼠,可顯著提高BMSC在心肌組織中的存活率，使其抑制心肌細胞凋亡的作用更加顯著。

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[3] 王永，范家偉，方五旺.犬自體骨髓間充質干細胞移植對心肌梗死后膠原纖維含量影響的實驗研究[J].醫學綜述，2010，16（23）：3656-3659.

[4] 徐燕，張瑤，李麗麗.骨髓間充質干細胞移植治療大鼠擴張型心肌病[J].中國組織工程研究，2012,16（14）:2576-2580.

[5] Semba RD,Cappola AR,Sun K,et al.Plasma Klotho and cardiovascular disease in adults [J].Am Geriatr Soc,2011,59（9）：1596-1601.

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