慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡、心肌纖維化及其相關(guān)性研究

魏 玲，李慧萍，魏 偉，劉 茜，尹 娜，甘世保，楊 靜，李麗娟，潘興華

心肌重構(gòu)是目前公認(rèn)的慢性心衰的病理生理機(jī)制，心肌細(xì)胞凋亡及心肌纖維化是其重要的病理基礎(chǔ)。本研究探討了慢性心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡及心肌纖維化的變化及其兩者的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型建立 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠 20 只，約 3 月齡，體重（300±30）g，由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[許可證號(hào)：SCXK（滇）2011-0005]，經(jīng)過(guò)適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分成心衰組及正常組。心衰組連續(xù)腹腔注射異丙腎上腺素，3 mg/(kg·d)，共14 d，以建立大鼠慢性心衰模型；正常組則同步腹腔注射等體積生理鹽水。末次注射后2 w，進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，以射血分?jǐn)?shù)≦50%為造模成功[1]。

1.2 心肌組織標(biāo)本的制備 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一夜，全部大鼠禁食、水，實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天稱取大鼠體重后，麻醉大鼠，剪開(kāi)胸腔，取出心臟，用冰生理鹽水洗滌血污，剔除脂肪、血管等非心肌組織后，無(wú)菌紗布吸干心臟表面，取左心室部分心肌組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制作心肌標(biāo)本石蠟切片。

1.3 HE染色 心肌標(biāo)本采用常規(guī)HE染色法，切片經(jīng)蘇木素染色后，用伊紅液復(fù)染，在光學(xué)照相顯微鏡下觀察并采圖。

1.4 Masson染色 心肌標(biāo)本石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水，Weigert鐵蘇木素染色5 min，自來(lái)水洗，用1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，流水沖洗數(shù)分鐘，麗春紅酸性品紅液染色5 min，蒸餾水快速?zèng)_洗，1%磷鉬酸水溶液處理5 min，不水洗用苯胺藍(lán)染液復(fù)染5 min，1%冰醋酸浸泡1 min，95%酒精多次脫水，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

1.5 TUNEL染色 心肌標(biāo)本石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水，用蛋白酶K工作液覆蓋組織，37℃孵育30 min。PBS沖洗3次，5 min/次。制備TUNEL染色混合液，取Tunel試劑盒內(nèi)適量 TdT和 dUTP按 2∶29混合，加到圈內(nèi)覆蓋組織，37℃孵育2 h，PBS沖洗3次，5 min/次。切片稍甩干后，每張切片加50 μl converter-POD覆蓋組織，37℃孵育30 min。PBS洗滌3次，5 min/次，切片上滴加適量DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，蘇木素復(fù)染3 min左右，自來(lái)水洗，將切片依次放入75%乙醇6 min、85%乙醇6 min、無(wú)水乙醇Ⅰ6 min、無(wú)水乙醇Ⅱ6 min、二甲苯Ⅰ5 min脫水透明，中性樹膠封片。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)，兩變量相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型建立 根據(jù)心臟彩超結(jié)果及判定標(biāo)準(zhǔn)（LVEF≤50%），心衰組制備心衰模型均成功。造模后2 w，正常組射血分?jǐn)?shù)為(73.56±5.12)%，顯著高于心衰組的(41.32±6.86)%（P＜ 0.01）。

2.2 兩組心肌組織結(jié)構(gòu)HE染色比較 HE染色結(jié)果顯示，心衰組心肌細(xì)胞肥大、壞死、心肌纖維化伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞間隙增大伴水腫。而正常組心肌組織心肌纖維排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常，未見(jiàn)上述病理改變（圖1）。

2.3 兩組心肌組織結(jié)構(gòu)Masson染色比較 正常組心肌組織纖維排列整齊，僅見(jiàn)少量的膠原纖維增生。心衰組心肌纖維化明顯，大量心肌細(xì)胞壞死被膠原纖維替代，殘留的心肌細(xì)胞排列紊亂。心衰組膠原容積比（CVF%）為（55.23±3.55）%，較正常組的（0.32±0.09）%顯著增加（P＜ 0.01）。

2.4 兩組心肌細(xì)胞凋亡比較 正常組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量很少，而心衰組心肌細(xì)胞凋亡率為(44.36±4.17)%，較正常組的 (1.25±0.66)%顯著增加（P＜0.01，圖 3）。

2.5 心肌膠原容積比與心肌細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性分析 心衰組心肌膠原容積比與心肌細(xì)胞凋亡率資料均呈正態(tài)分布，Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，心肌膠原容積比與心肌細(xì)胞凋亡呈顯著正相關(guān)（r=0.893，P＜ 0.01）。

3 討論

心臟重構(gòu)是指心臟受到缺血損傷、神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)過(guò)度激活、血流動(dòng)力學(xué)改變等慢性刺激后，以心肌細(xì)胞肥大、心肌細(xì)胞凋亡及心肌纖維化為特征的病理表現(xiàn)，導(dǎo)致心臟外觀、大小和功能變化，既是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的決定機(jī)制，也是心功能障礙的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。心肌細(xì)胞死亡包括心肌細(xì)胞自噬、壞死及凋亡3種形式，其發(fā)生在各種心血管疾病，如心力衰竭、心肌梗死、心肌缺血再灌注的急性及慢性期，其中心肌細(xì)胞凋亡即是心肌細(xì)胞死亡的主要形式[2]。成人心肌細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞，當(dāng)心肌組織遭受缺血、缺氧、氧化應(yīng)激及壓力超負(fù)荷時(shí)，結(jié)果會(huì)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞受損傷，心肌細(xì)胞凋亡，心肌細(xì)胞數(shù)量減少和心肌纖維化[3]。

圖1 兩組心肌組織結(jié)構(gòu)HE染色比較（400×）

圖2 兩組心肌組織結(jié)構(gòu)Masson染色比較(400×)

圖3 兩組心肌細(xì)胞凋亡比較(400×，TUNEL染色)

心肌細(xì)胞凋亡是代償性心肌重構(gòu)轉(zhuǎn)向心力衰竭的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是心臟功能進(jìn)行性惡化及最終死亡的重要基礎(chǔ)[4]。紐約心臟病協(xié)會(huì)報(bào)道，心功能Ⅲ、Ⅳ的心衰患者的心肌凋亡比占心肌組織的0.12%～0.70%，而正常心肌組織只占0.001%～0.01%[5]。Van等[6]研究發(fā)現(xiàn),如果某心肌組織中的心肌細(xì)胞凋亡率＞0.1%時(shí)，該心肌組織每年會(huì)有近37%的心肌細(xì)胞死亡。研究報(bào)道，自發(fā)性高血壓大鼠發(fā)生心肌肥厚及心肌細(xì)胞凋亡時(shí)，其心肌細(xì)胞凋亡數(shù)是正常組的4倍[7]。心肌纖維化是心功能障礙、心臟驟停及心律失常的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，也是心臟重構(gòu)的一大病理特征[8]。根據(jù)有無(wú)心肌細(xì)胞壞死及心肌瘢痕組織形成，心肌纖維化分為反應(yīng)性纖維化及修復(fù)性纖維化。反應(yīng)性纖維化又分為間質(zhì)纖維化及血管周圍纖維化，其不出現(xiàn)心肌細(xì)胞壞死及瘢痕的形成；修復(fù)性纖維化心肌組織將出現(xiàn)心肌細(xì)胞壞死及瘢痕組織。心肌纖維化導(dǎo)致心臟僵硬度增加、順應(yīng)性降低，心臟傳導(dǎo)阻滯，心臟收縮及舒張功能障礙，最終導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)生[9]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，心衰組心肌纖維化較正常組顯著增加，存在心肌細(xì)胞廣泛壞死、心肌纖維斷裂溶解、心肌間質(zhì)膠原纖維過(guò)度沉積，大片狀瘢痕組織增生，心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，且心肌細(xì)胞凋亡率也顯著升高，提示慢性心衰大鼠存在心肌細(xì)胞凋亡率與心肌纖維化，且二者之間的變化呈顯著正相關(guān)。

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