山羊胎肝內定位注射不同體積間充質干細胞對胎羊發育的影響

黃小昆，龍 海，蘇錫雄，楊艾梅，李自安，余 璞，王 強，劉菊芬，王金祥，潘興華，龐榮清，許立奇

宮內干細胞移植（inuterostemcelltransplantation）是建立嵌合體模型的有效方法，比如Flake等[1]和黃淑幀等[2]課題組就采用B超引導下胎羊腹腔內注射人造血干細胞的方法成功建立了人-羊嵌合體模型，并證實移植的人源細胞可在嵌合體動物肝臟等多個組織器官中廣泛存在[3]。如果采用宮內干細胞移植的方法將干細胞直接注射到胎羊肝臟，理論上來說將非常有利于嵌合體肝臟的形成。因此，本研究探索B超引導下定位注射干細胞到山羊胎肝的技術方法，為通過宮內干細胞移植途徑建立嵌合體模型并開展相關實驗研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、材料和儀器 DMEM/F-12培養基(Hyclone公司)；胎牛血清和0.25%胰蛋白酶（均為BI公司）；倒置熒光相差顯微鏡（NIKON公司）、熒光顯微鏡（Lwica DMI3000B）、流式細胞儀（BD 公司）；超聲波穿刺針（CREATE MEDIC株式會社）；B型超聲多普勒（PHILIPSIU22）。

1.2 實驗動物 1月齡雄性云南烏骨山羊1只，疑似懷孕1.5～3個月的云南烏骨母山羊10只，均來源于云南農業大學。

1.3 實驗方法

1.3.1 山羊骨髓間充質干細胞制備 于1月齡雄性山羊髂骨后棘處無菌穿刺針采集1～2 ml肝素抗凝骨髓。參照課題組建立的分離培養方法分離間充質干細胞[4]，即在無菌條件下，以1000 r/min離心3 min,漂洗后用含10%胎牛血清的DMEMF12培養液重懸骨髓細胞，轉移至培養瓶中于37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱內靜置培養，適時換液并傳代。

1.3.2 懷孕山羊的鑒定 疑似懷孕母羊10只，禁食禁水12 h，腹部備皮后固定于實驗臺上，B超探查確定胎兒的存在，觀察胎兒數量、胎兒性別和發育狀況。

1.3.3 超聲引導下山羊胎肝穿刺和定位注射 在母羊懷孕約3個月時，將超聲探頭置于懷孕山羊腹部，確定胎羊位置及穿刺點，然后利多卡因局部浸潤麻醉預穿刺點，調整超聲探頭角度，固定消毒后的固定架于超聲探頭，將無菌穿刺針置于固定架穿刺孔，小心刺入母羊腹壁并進入胎肝，拔出針芯連接備有細胞的注射器，注射細胞后拔出穿刺針，壓迫止血。注射完畢，將母羊置于圈舍精心飼養，觀察胎羊出生與流產情況。注射方案見表1。

2 結果

2.1 骨髓間充質干細胞制備 采用髂骨后棘穿刺法可一次性獲得骨髓至少0.5 ml，采用全骨髓培養法，即采用含10%胎牛血清的DMEM-F12培養液懸浮細胞并靜置培養的方法，可以在10 d內觀察到很多長梭狀貼壁生長的細胞（圖1A），傳代后可獲得密集排列呈旋渦狀生長的細胞（圖1B）。傳代5代即可獲得滿足實驗需要量，用生理鹽水懸浮細胞并調整濃度為2.1×107cell/ml的懸液備用。

圖1 山羊骨髓間充質干細胞（4×10）

2.2 懷孕山羊的準備 借助B超，可以清晰觀察到懷孕1.5～3個月的母羊腹腔臟器分布和胸腔輪廓清晰的胎羊，并可觀察到明顯的胎心收縮和舒張以及動態血流影像甚至胎動（圖2A），可監聽到節律整齊的心音（圖2B）。10只交配后疑似懷孕1.5～3個月的母羊中有6只懷孕，其中，5只懷有1胎，1只懷有2胎，7只胎羊性別為雌性4只，雄性3只。

2.3 胎肝內定位注射 在B超顯像下，可清晰觀察到胎心節律性跳動，以此可確定位于胎心旁的胎肝位置，通過觀察肝臟形態及血流動態即可準確識別并確定胎肝的位置（圖3A）。調整超聲探頭及固定架的角度確保穿刺針進針方向正確之后，通過超聲動態現象可以清晰顯示進針位置（圖3B），避開血管，觀察推入少許氣泡后白色亮點的存在和位置（圖3C），即可準確定位穿刺針針尖的位置處于胎肝實質區域。連接備有間充質干細胞懸液的注射器，即可將1 ml或4 ml的間充質干細胞懸液準確注入胎肝實質區域。

2.4 懷孕母羊的觀察與流產 胎羊肝臟接受定位注射生理鹽水懸浮的雄性山羊骨髓間充質干細胞懸液后得到結果見表1，其中A組2只肝臟注射了1ml（含2.1×107個細胞）的雌性胎羊順利出生，其中之一為雙胞胎的雌性胎羊接受注射而另一只雄性胎羊沒有注射均順利出生。B組注射了相同容積但4倍數量的細胞的胎羊也順利出生，這4只母羊穿刺后飲食正常，精神狀態良好，最終順利產下了5只發育良好的羊羔。C組2只懷孕母羊的胎肝內注射了4倍容積但與B組相同數量的細胞，3 d后母羊精神萎靡嗜睡，分別于穿刺后第8天和第10 d發生流產，產下了死胎，母羊存活。

3 討論

圖2 懷孕母羊診斷的超聲影像圖

圖3 胎肝內定位注射超聲影像圖

表1 超聲引導下不同注射方案和產羔結果

B超顯像不但能夠獲得組織器官的解剖圖，顯示器官的外形、內部回聲，而且還可以顯示動態臟器的結構和功能[5]，也可用于對妊娠期產婦甚至產時進行胎心監護，及時發現胎兒生理發育狀況[6-7]。本研究結果顯示，1.5個月以上的胎羊均可在B超顯像條件下清晰地觀察到胎心的跳動和心音、顯示胎肝位置及肝臟血流動態位置。宮內干細胞移植是建立嵌合體模型的有效方法，借助B超，可以準確診斷懷孕1.5個月以上母羊懷的是單胎還是雙胎及胎羊性別，并可準確定位所需穿刺點。懷孕單胎山羊適于精確定位注射建立嵌合體模型，懷孕雙胎山羊適于開展干細胞遷移與分化的實驗研究，胎羊性別的確定有助于進行性別錯配設計便于嵌合體鑒定分析。

云南烏骨山羊性情溫順，通常懷有單胎，孕期5個月，體型中等，腹壁皮下脂肪少，便于開展嵌合體研究。本研究顯示：在B超引導下可以準確確定1.5月齡以上胎羊肝臟位置并準確穿刺注射BMSC細胞懸液到胎肝實質區域。注射1 ml細胞懸液的條件下，BMSC數量增加4倍不會導致胎羊流產，但BMSC數量不變，注射4 ml體積的細胞懸液則100%（2/2）導致流產，這說明發育過程中的烏骨山羊胚胎可以接受大量同種MSC但不能接受大容積的細胞懸液，這可能與注射過多體積的生理鹽水細胞懸液進入胎肝、改變了胚胎發育的內環境有關。超聲引導下將間充質干細胞移植到胎肝內，是一種無需手術的定位穿刺移植方法，可多次注射，是制備嵌合體肝臟的理想技術方案。本研究為嵌合體肝臟制備及肝病的發病機制、藥物代謝以及干細胞體內分化的研究提供了模型基礎。

[1] Flake AW,Harrison MR,Adzick NS,et al.Transplantation of fetalhematopoietic stem cells in utero:the creation of hematopoietic chimeras[J].Science,1986,233(4765):776-778.

[2] Zeng F,Chen M,Katsumata M,et al.Identification and characterization ofengrafted human cells in human/goat xenogeneic transplantation chimerism[J].DNA Cell Biol,2005,24(7):403-409.

[3] Qian H,Wang J,Wang S,et al.In utero transplantation of human hematopoietic stem/progenitorcellspartially repairs injured liver in mice[J].Int J Mol Med,2006,18(4):633-642.

[4] 龐榮清，何潔，李瑞生，等.食蟹猴臍帶間充質干細胞的分離與鑒定[J].中國比較醫學雜志，2015，25（4）：66-69.

[5] 譚靜,劉軍,張文軍,等.多普勒超聲評價晚孕和臨產前臍帶繞頸胎兒大腦中動脈血流動力學與圍生兒臨床結局[J].四川醫學,2015,36(11):1514-1517.

[6] 張文文.胎兒宮內窘迫 541例剖宮產指征分析[J].中國實用醫藥,2015,10(34):89-90.

[7] 謝學萍,鄧捷.產時胎心監護的臨床效果觀察及護理[J].齊齊哈爾醫學院學報,2015,36(28):4353-4354.