UCMSC對放射傷樹鼩淋巴細胞表達Th1/Th2類細胞因子的干預作用

郭德鑌，李青青，王金祥，劉菊芬，王 強，楊建勇，朱向情，潘興華,楊 嬡

造血微環境和免疫細胞對電離輻射具有高度敏感性，而電離輻射又能催化炎癥細胞與炎癥因子相互作用，加重造血免疫紊亂，但機制尚未闡明，有研究提示這可能與輔助性T細胞的Th1/Th2的異常或失衡有關[1]。臍帶間充質干細胞（UCMSC）具有較強的免疫調節和促進造血重建作用，預計UCMSC對放射性組織損傷及其誘導的炎癥、免疫反應可產生治療效應。有研究證明，在體外T細胞可被PHA、異種抗原、CD3、CD28抗體等刺激活化增殖，而與MSC共培養時，T細胞增殖整體受到抑制，Th1細胞因子分泌減少，Th2細胞因子分泌增加[2]。為探索UCMSC體內移植對淋巴細胞增殖是否有相似的作用，本實驗觀察了UCMSC治療對放射傷樹鼩外周血和脾淋巴細胞表達Th1/Th2類細胞因子的影響，進而探討UCMSC調節造血免疫功能的作用機制，為臨床運用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 DMEM/F12培養基（Hyclone），胎牛血清、0.25%胰酶（BI）,鼠抗人CD31/CD34/CD44/CD90（4ABiotech），高純總 RNA 提取試劑盒（BioTeke），熒光定量 PCR-Mix（SYBR Green），PCR 反轉錄試劑盒（Promega），LifeECO 基因擴增儀(BIOER)，C1000 PCR 儀（BIO-RAD），FACScabilur流式細胞儀（BD 公司），基因引物（GAPDH、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6）由昆明碩擎、碩陽公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 UCMSC的復蘇、培養、鑒定 UCMSC取自本科室建立的樹鼩UCMSC庫，參考文獻[3]方法復蘇細胞。待細胞生長達95%融合后，0.25%胰酶消化， 收集細胞（1×105個/管），PBS洗滌， 分別加入CD31/CD34/CD44/CD90單克隆抗體，流式細胞術分析UCMSC的表型。

1.2.2 實驗動物及分組 成年雄性樹鼩30只，體重（125.8±9.2）g，由中國科學院昆明動物所提供，生產許可證號：SCXK(滇)K2012-0001。隨機分為模型組（15只）、治療組（15只）。將所有樹鼩置于自制的塑料盒內，接受全身一次性4.5 Gy電離輻照，照射劑量及方法參照文獻[4]。治療組于照射后當日開始經股靜脈輸注UCMSC3×107個/kg），模型組則給予同體積生理鹽水，均1次/w，連續治療4次。實驗期間，所有樹鼩均普通喂養。

1.3 觀察指標 在末次治療后1 w，分別統計或檢測兩組下列指標。（1）樹鼩存活率；（2）外周血和脾Th1/Th2細胞因子mRNA表達：脫頸處死存活樹鼩，參照文獻[5]方法,制備脾單細胞懸液，用試劑盒提取RNA。RNA反轉錄成cDNA。需檢測的Th1/Th2細胞因子目的基因（TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6）PCR 引物序列見表1。采用實時熒光定量PCR反應，各熒光曲線與基線交叉點的循環數為Ct值。依據公式△Ct=CT目的基因-CTβ-actin與△△Ct=2-△Ct， 計算檢測基因的mRNA相對表達量，每組重復3次取平均值。

1.4 統計學方法 應用SPSS 21.0統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 UCMSC的培養和鑒定 復蘇后的樹鼩UCMSC貼壁生長，大小均一，形態規整，長梭形，呈平行排列或旋渦狀生長，低密度時細胞較扁平，高密度時細胞稍細長。流式細胞儀檢測UCMSC表面標記CD31/、CD34、CD44、CD90 陽 性 細 胞 率 分 別 約 為:0.2%、0.2%、99.7%、99.8%。

2.2 生存率比較 在照射后4 w，模型組存活率為 53.33%（8/15），治療組為 86.77%(13/15)，兩組比較差異顯著（P＜0.05），模型組結果與本課題組前期報道的制備模型相似[4]，表明模型復制成功。

2.3 兩組外周血和脾Th1/Th2細胞因子mRNA表達 在連續4次UCMSC治療后1 w，治療組外周血和脾 Th1細胞因子（TNF-α、IL-2）均低于模型組（P＜0.05）， 而外周血和脾Th2 細胞因子（IL-4、IL-6）均高于模型組（P＜0.05）。 見表 2、3。

3 討論

機體的免疫系統對電離輻射具有高度敏感性，即使低劑量的輻射，也能造成免疫失衡。輔助T淋巴細胞是執行免疫防御的重要細胞，主要分為Th1、Th2細胞亞群，正常情況下，兩種細胞亞群通過分泌的細胞因子相互制衡。如果受到外界干擾導致Th1/Th2失衡，則會觸發異常免疫應答，造成病理狀態[6]。Th1、Th2細胞一般通過測量其特定分泌的細胞因子來間接反映二者比例。Th1細胞主要分泌IL-17、TNF、IL-2、IFN-γ，參與細胞免疫；Th2 細胞主要分泌IL-4、IL-6、IL-5、IL-10，參與體液免疫。

表1 Th1/Th2細胞因子mRNA引物序列

表2 兩組外周血h1/h2細胞因子相對表達量比較

表2 兩組外周血h1/h2細胞因子相對表達量比較

注:與治療組比較,①P＜0.05

Th1細胞因子 Th2細胞因子組別 TNF-α IL-2 IL-6 IL-4治療組(n=13) 1.00±0.03 1.00±0.09 1.00±0.15 1.00±0.08模型組(n=8) 2.58±0.22 3.98±0.11 0.14±0.01 0.21±0.09

表3 兩組脾Th1/Th3細胞因子相對表達量比較

Th1、Th2細胞因子的檢測可使用ELASA試劑盒、流式或實時熒光定量PCR等方法檢測，但由于樹鼩特異性抗體缺乏的限制，最終本實驗決定采用實時熒光定量PCR法檢測樹鼩外周血和脾淋巴細胞分泌的 Th1/Th2 細胞因子 TNF-α、IL-2、IL-6、IL-4，探討UCMSC對體內Th1/Th2細胞因子的平衡調節。結果顯示，模型組外周血和脾Th1細胞因子（TNF-α、IL-2）均高于治療組（P＜0.05），提示電離輻射促進TNF-α、IL-2的分泌，Th1/Th2平衡向Th1方向飄移，與文獻報道相似[7]。IL-2是T細胞生長因子，能刺激T細胞進人細胞分裂周期，增強T細胞的殺傷活性；TNF-α能刺激纖維母細胞增殖，促進凝血因子和組織因子活性，增強中性粒細胞對血管內皮的粘附性，加速血管出血壞死，還能誘導IL-2的產生。模型組外周血和脾Th2細胞因子（IL-4、IL-6）均低于治療組（P＜0.05），提示UCMSC移植后促進Th2細胞因子優勢化。IL-4可單獨維持Th2細胞的增殖，抑制TNF的分泌，還可協同CSF刺激造血細胞的增殖，協同G-CSF增強粒細胞集落形成，協同EPO增強BFU-E的形成，減輕炎癥反應，進而維持造血微環境的穩定。IL-6具有復雜的生理功能，它可誘導B細胞分化并產生抗體，促進T細胞增殖，促進骨髓造血干細胞增殖，增強血細胞分化,且不同的刺激對IL-6有不同的主導作用，會導致機體不一樣的免疫反應。

綜上所述，UCMSC移植治療放射損傷樹鼩，可促進體內外周血和脾中Th1向Th2細胞飄移，結果為細胞治療放射損傷提供理論依據，但UCMSC對細胞因子的調控機制有待深入研究。

[1] Shimizu Y,Kuwabara H,Ono A,et al.Intracellular Th1/Th2 balance of pulmonary CD4(+)T cells in patients with active interstitial pneumonia evaluated by serum KL-6 [J].Immunopharmacology and Immunotoxicology,2006,28(2):295-304.

[2] Wen S,Dooner M,Cheng Y,et al.Mesenchymal stromal cell derived extracellular vesicles rescue radiation damage to murine marrowhematopoieticcells[J].Leukemia,2016,30(11):2221-2231.

[3] 何潔,趙晶,王金祥,等.凍存臍帶間充質干細胞的臨床前制備[J].西南國防醫藥,2016,26(12):1365-1369.

[4] 王強,王永剛,馬洪磊,等.樹鼩急性放射損傷模型的建立[J].西南國防醫藥,2016,26(12):1391-1394.

[5] 陳榮伴.急性髓性白血病患者外周血T淋巴細胞亞群及Th1/Th2細胞因子的變化及其臨床意義[J].臨床和實驗醫學雜志,2015(16):1356-1358.

[6] Cher DJ,Mosmann TR.Two types of murine helper T cell clone.Ⅱ.delayed-type hypersensitivity is mediated by Th1 clones[J].Journal of Immunology,1987,138(11):3688-3694.

[7] R?del F,Frey B,Multhoff G,et al.Contribution of the immune system to bystander and non-targeted effects of ionizing radiation[J].Cancer Letters,2015,356(1):105-113.