氨茶堿藥物代謝動力學實驗研究

李 霽陽 劍*張 源

（1 昆明醫科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650021；2 昆明醫科大學第一附屬醫院骨科，云南 昆明 650032）

藥代動力學是藥學、藥物制劑、臨床藥學等專業的主干專業課程之一，廣泛應用于新藥篩選、制劑研究和藥物質量評價、臨床合理用藥等方面，是一門實踐性很強的課程[1-2]。藥物代謝動力學實驗是教學的重要組成部分，是理論與實踐結合的主要方式之一，我校主要是臨床藥學專業開設了藥代動力學實驗課。其中“氨茶堿在兔子體內藥代動力學研究”中藥動參數的測定是主要的實驗內容之一，對于學生理解并掌握通過血藥濃度的測定來獲取藥物的藥動參數具有重要的指導意義，實驗內容包括血樣的采集、樣品前處理、血藥濃度的測定及實驗數據處理。在實驗帶教過程中，筆者認為在檢測過程中，當選擇274 nm作為檢測波長時，血中的內源性成分在該波長處有吸收，對測定有干擾，有必要選擇更為合理的測定方法，使測定結果更為準確合理；此外實驗中使用5%異丙醇-氯仿作為提取溶劑，對人體毒性大且污染環境，需要尋找一種能夠滿足氨茶堿藥代動力學研究要求，替代氯仿，安全的提取溶劑。因此經過分析、查閱資料、預實驗，對實驗方法進行了改革，改革后的實驗方法結果重現性好、準確度高，提取回收率較高，能夠滿足氨茶堿藥代動力學實驗要求，且無毒無害，適合學生教學實驗。現報告如下。

1 氨茶堿藥代動力學研究的實驗現況

我校采用的藥代動力學實驗講義中，氨茶堿在兔體內藥代動力學研究是通過給家兔耳靜脈給藥注射用氨茶堿后耳靜脈取血，使用5%異丙醇-氯仿對血樣進行液液萃取前處理后采用紫外分光光度法在274 nm處測定血藥濃度，然后進行數據處理：繪制藥時曲線、將測得的血藥濃度代入藥動公式求算消除速率常數K、半衰期t等藥動參數。實驗內容包括血樣的采集、血樣的前處理、血藥濃度的測定及實驗數據處理。其中生物樣品前處理和血藥濃度測定是本實驗的重要內容，涉及到后續測定是否準確合理。

目前氨茶堿的含量測定方法主要有紫外分光光度法[3-4]HPLC法[5-6]，因紫外分光光度法操作簡捷、結果準確、專屬性強、儀器價格便宜而被廣泛用于學生實驗中。在以前設計的實驗中，選擇紫外光274 nm下測定氨茶堿血藥濃度，使用5%異丙醇-氯仿進行液液萃取，實驗得率高，現性好，但最主要的問題血中內源性成分在274 nm下有吸收，容易產生干擾，使結果不夠準確；此外提取溶劑氯仿毒性大，對心、肝、腎有損害，吸入后容易中毒，在學生實驗中使用不合適，為此需要改進檢測方法，提高方法的準確性，并且尋找到提取率能夠滿足氨茶堿藥代動力學研究的、合適的提取溶劑，從而替代氯仿。

2 改革后的實驗方法

2.1 家兔空白血的采集 取體重3 kg左右家兔1只，耳緣動脈取血或心臟取血20～80 mL，置于加有肝素的10 mL具塞離心管中，離心 (3000 rpm/min)10 min，取血清供標準曲線制備用。

2.2 標準曲線的制備 取氨茶堿標準品，精密稱量以0.1 mol/L NaOH溶液配成500 mg/L的貯備液。另取試管5支，各加入0.5 ml空白血清，然后依次加入上述貯備液4.0 μL、8.0 μL、12.0 μL、16.0 μL、20.0 μL，各加入0.1 mol/L NaOH溶液至4.0 mL，其濃度分別為0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、1.5 μg/mL、2.0 μg/mL、2.5 μg/mL的標準液。按生物樣品前處理，用紫外分光光度計在波長274 nm及波長298nm處測定吸收度A274、A298（以空白血清按生物樣品前處理后作空白對照）以吸收度差△A（A274-A298）對含藥量C進行線性回歸，結果見圖1。

圖1 氨茶堿標準曲線

2.3 生物樣品前處理 取血清樣品0.5 mL置試管中，加0.1 mol/L鹽酸溶液0.2 mL，乙酸乙酯液5 mL，振搖混合，離心（3000 r/min） 10 min。吸取乙酸乙酯4.0 mL置于另一試管中，加入0.1 mol/L NaOH溶液4.0 mL，混勻，離心10 min，吸取堿液（上層）3～3.5 mL，用紫外分光光度計，測定堿液在波長274 nm和波長298 nm處的吸收度A274、A298。

2.4 稀釋效應 考慮到氨茶堿靜注給藥血清樣品濃度高，需用兔空白血清稀釋，以滿足氨茶堿的血清標準曲線線性范圍。由預試驗結果可知，部分兔血清樣品需要稀釋，稀釋倍數為5、25倍。因此，需要考察氨茶堿血清樣品的稀釋效應。由于將血清樣品直接稀釋25倍會引入較大的操作誤差，因此本實驗操作將高濃度血清樣品先稀釋5倍，再將稀釋5倍后的血清樣品稀釋5倍，由此得到稀釋25倍的血清樣品。

為此，血清樣品的稀釋效應考察方法如下：配制成濃度為10.0 μg/mL的氨茶堿標準血清樣品，分析前樣品保存于20℃，分析時將其稀釋5倍，得到濃度為2.0 μg/mL樣品，按上述氨茶堿血清樣品預處理步驟操作并進樣分析，所得氨茶堿吸光度差值△A代入隨行標準曲線，計算相應濃度，乘以相應的稀釋倍數即獲得高濃度血清樣品的實際測定濃度，通過與標準添加濃度相比較，計算其百分回收率與RE值，結果見表1。

表1 氨茶堿稀釋效應考察 （n=5）

2.5 家兔體內血藥濃度的測定

2.5.1 血樣的采集 選用雄性家兔稱重，按10 mg/kg劑量給藥，以5%葡萄糖溶液稀釋氨茶堿注射劑10倍，由耳靜脈給藥（2 min內注完）。然后分別于0.167 h、0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h取血約2 mL（另一耳靜脈取血）。分離血清（試管不涂肝素，靜置，離心2000 rpm），備用。按生物樣品前處理，用紫外分光光度計在波長274 nm及波長298 nm處測定吸收度A274、A298，計算吸收度差△A后，代入標準曲線方程得到氨茶堿血藥濃度。

2.6 實驗數據處理 繪制藥時曲線，將測得的血藥濃度代人藥動公式求算消除速率常數K、半衰期t等藥動參數。

3 結果

用改進后的實驗方法進行實驗，測得血藥濃度數據見表2，繪制的藥時曲線見圖2。由實驗結果可知，測得的血藥濃度數據符合對氨茶堿在家兔體內的代謝情況，與靜脈給藥藥-時曲線的規律一致，且在實驗過程中發現改進后的方法對血樣進行處理后所得的樣品澄明，血藥濃度測定結果穩定，重現性好。

表2 血藥濃度測定結果

圖2 血藥濃度-時間曲線

4 討論

4.1 實驗特點 本實驗在生物樣品前處理過程中使用乙酸乙酯作為萃取溶劑來替代原先使用的萃取溶劑5%異丙醇-氯仿，提取回收率較高，滿足藥動學實驗需要。此外使用兩點校正法測定并計算血藥濃度，較之前在274 nm測定血藥濃度，該方法更加準確，能夠扣除血樣中其他內源性雜質的干擾，血藥濃度測定結果穩定，重現性好。實驗無毒無害，適合學生操作。

表2 改革前后實驗比較

4.2 實驗收獲 本次實驗各項工作包括文獻查閱、實驗方案設計到實際操作、儀器使用、數據處理等多項工作都是筆者帶領學生完成，學生在參與本次實驗改革中，熟練掌握了查閱國內外文獻的方法，了解了科學研究的基本思路與流程，加深了對藥物動力學基本理論知識的理解，掌握了相關儀器的使用以及獲得較強的數據處理能力。實驗過程中，學生充分利用數據庫資源，在實驗中遇到的相關問題能夠通過查閱文獻，設計、改進實驗，有效激發了獨立思考，對于培養學生獨立分析、解決實際工作中出現的問題及動手能力有很大的幫助。實踐證明，本次實驗改革，相對于以前的實驗課程，增加實驗的科學性和合理性，讓學生更深層地理解了藥代動力學實驗的過程、意義，實驗結果更為準確合理，試劑對環境和人體無害，適合學生教學實驗。

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