IMP3在高齡葡萄胎及侵蝕性葡萄胎孕婦中的表達研究

曹雪霞 張麗娟* 張梅娜 常海麗 楊 敏 趙敏英 董 靜 張 娜 宋 潔 劉玉娜 劉 莉 謝禎芳

滋養細胞來源于胚胎的胚外層細胞，早期胎盤的滋養細胞具有許多類似惡性腫瘤的特性，表現為迅速增生并侵蝕子宮內膜。常見的妊娠滋養細胞疾病(gestational trophoblastic diseases，GTD)包括葡萄胎(hydatidiform mole，HM)、侵蝕性葡萄胎(invasive hydatidiform mole，IHM)和絨毛膜癌(choriocarcinoma，CCA)，其病理特征為滋養細胞的異常增生[1]。其中HM是妊娠后胎盤絨毛滋養細胞異常增生間質水腫所形成，良性HM主要局限在宮腔，大多數可經清宮治愈；而IHM多繼發于HM之后，具有局部浸潤和(或)遠處轉移的能力，是常見的一種婦科滋養細胞腫瘤。

胰島素樣生長因子ⅡmRNA結合蛋白3(insulinlike growth factor ⅡmRNA-binding protein 3，IMP3)是一種癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)，是ⅡmRNA結合蛋白家族中的一員[2]。近年來，因其在各種惡性腫瘤的細胞侵襲和粘附中起到重要作用而備受關注。本研究通過分析其在40歲以上HM和IHM患者經聯合化療行子宮切除術術后的表達，了解其在HM惡化進展中的作用和對IHM病情的評估，為其預后判斷提供新的方法和依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

(1)選取1990年9月至2010年9月河北醫科大學第二醫院的103例40歲以上HM患者清宮術后病理存檔石蠟組織標本，對病例進行回顧性研究。其中年齡40～56歲；按照檢測患者組織標本中血清β-人絨毛膜促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin，β-hCG)水平的不同，將其分為觀察組(β-hCG＞2×105mIU/ml，67例)和對照組(β-hCG＜2×105mIU/ml，36例)。觀察組平均年齡(47.06±0.61)歲；對照組平均年齡(46.78±0.41)歲。

(2)選取88例40歲以上IHM患者經化療行子宮切除術石蠟包埋組織標本，年齡40～57歲，按照β-hCG水平的不同，將其分為觀察2組(β-hCG＞2×105mIU/ml，52例)和對照2組(β-hCG＜2×105mIU/ml，36例)。均為臨床Ⅰ期，術前均行雙槍化療，平均(3.55±1.83)個療程。觀察2組平均年齡(46.89±0.50)歲，預后評分≥7分；對照2組平均年齡(46.72±0.54)歲，預后評分≤6分。所有病例為臨床明確診斷，由病理證實。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 儀器與試劑

(1)主要儀器。LEICA RM2135型石蠟切片機(德國Leica公司)；OLYMPUS CX21型光學照相顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；ZPJ-1型展片機(天津天利公司)；隔水式電熱恒溫培養箱(上海醫用恒溫設備廠)；XMT-H型數顯溫控儀(上海滬南科學儀器聯營廠)。

(2)主要試劑。兔抗人IMP3多克隆抗體(英國Abcam公司)；免疫組化試劑盒[鏈霉親和素-過氧化物酶(streptavidin-perosidase，SP)，北京鼎國生物技術有限公司]；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；氨丙基三乙氧硅烷(3-amino propyltri ethoxy silane，APES)防脫片試劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3 試驗方法

所有蠟塊標本以5 μm厚度切片制片，每張切片經蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色、常規病理形態學觀察證實后納入，采用SP法進行染色，與已知陽性對照切片進行陽性對照，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)代替一抗作為陰性對照。

1.4 觀察與評價指標

(1)觀察比較103例40歲以上HM患者IMP3基因在HM中的表達情況；觀察比較88例40歲以上IHM患者IMP3基因在IHM中的表達情況。

(2)IMP3基因位于細胞漿，以細胞漿內出現棕黃色或棕褐色的染色定為陽性。參照免疫組織化學反應結果的評定標準，采用顯色強度結合陽性細胞百分比法判讀結果，細胞漿內出現深棕色顆粒(強陽性)為3分，出現淡黃色顆粒(弱陽性)為1分，介于兩者之間(中度陽性)為2分[3]。在高倍鏡視野下計算滋養細胞的陽性細胞數的百分率，陽性細胞數分為4級：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分。根據顯色程度判定陽性程度分為4級：基本不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將染色強度分值與陽性細胞百分率分值相乘之積為每個視野得分，共5個高倍視野，每個視野平均值為最后得分：0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為中等陽性(++)，＞6分為強陽性(+++)。

表2 IMP3在觀察2組和對照2組IHM患者中治療前后的表達

1.5 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件對數據進行統計分析，組內進行卡方檢驗，組間用秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IMP3基因在HM中的表達

(1)觀察組中IMP3陽性表達24例，其中強陽性表達7例，一般陽性表達11例，弱陽性表達6例，IMP3陽性表達率為35.82%(24/67)；惡變為IHM的16例，惡變率為66.67%(16/24)。IMP3陰性表達43例，惡變為IHM的8例，惡變率為18.60%(8/43)。IMP3陽性表達與陰性表達的惡變率比較，其差異有統計學意義(x2=15.477，P＜0.05)。觀察組HM的IMP3陽性表達如圖1所示。

圖1 β-hCG＞2×105 mIU/ml時HM的IMP3陽性表達病理圖(×200)

(2)對照組中IMP3的陽性表達3例，其中強陽性表達0例，陽性表達1例，弱陽性表達2例，陽性表達率為8.33%(3/36)；惡變為IHM的3例，惡變率為100%(3/3)；IMP3陰性表達33例，惡變為IHM的7例，惡變率為21.21%(7/33)。IMP3陽性表達與陰性表達的惡變率比較，差異有統計學意義(x2=1.61，P＜0.05)。對照組HM的IMP3陰性表達如圖2所示。

(3)觀察組IMP3陽性表達率(35.82%)與對照組IMP3陽性表達率(8.33%)比較，其差異有統計學意義(x2=9.148，P＜0.05)，見表1。

圖2 β-hCG＜2×105 mIU/ml時HM的IMP3陰性表達病理圖(×200)

表1 兩組IMP3在HM患者中的陽性表達率比較

2.2 IMP3在IHM中的表達

IMP3蛋白于兩組患者IHM滋養細胞的胞漿中均有表達，觀察2組化療前IMP3的陽性表達率為94.23%(49/52)，化療后IMP3的陽性表達率為82.69%(43/52)。對照2組化療前IMP3的陽性表達率為77.78%(28/36)，化療后IMP3的陽性表達率為58.33%(21/36)。兩組化療前和化療后IMP3的陽性表達率比較差異具有統計學意義(x2=3.868，x2=6.364；P＜0.05)，見表2。

3 討論

目前，滋養細胞腫瘤臨床治療評估和預后觀察主要依據血清β-hCG，隨著分子生物學和生物醫學的不斷發展，腫瘤相關基因在滋養細胞腫瘤中的研究日益進展。IMP3是一種新識別的癌胚核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)結合蛋白。IMP3基因是人胰島素樣生長因子ⅡmRNA結合蛋白家族(IMP1，IMP2，IMP3)的成員之一，該家族成員在胚胎形成早期的RNA運輸、穩定、細胞生長和遷移中起著重要作用[4-5]。近年來研究發現，IMP3可能參與多種腫瘤的發生，發展而受到廣泛關注，有可能成為一種新的腫瘤標記物。

研究表明，IMP3基因在大鼠和人類早期胚胎發育時期在胎盤組織中有表達，而在正常成人組織中幾乎無表達。妊娠滋養細胞疾病是一組來源于胎盤滋養細胞的疾病，滋養細胞來源于胚胎的胚外層細胞。HCG是滋養細胞疾病特異及敏感的腫瘤標記物，是診斷與治療監測的主要參照指標，HCG＞10萬和年齡＞40歲認為是與HM發生局部轉移和(或)遠處轉移和滋養細胞腫瘤預后有關的高危因素。

本研究結果顯示，IMP3基因在40歲以上HM患者組織中高表達，且在血清β-hCG＞2×105mIU/ml時表達率較血清β-hCG＜2×105mIU/ml時明顯升高，提示IMP3可能參與了HM的發生發展，故其在HM發生局部侵蝕和遠處轉移方面具有一定的預測作用。在40歲以上IHM患者組織中，IMP3亦有表達，在血清β-hCG＞2×105mIU/ml時IMP3的陽性表達率高于血清β-hCG＜2×105mIU/ml，兩者比較差異有統計學意義，提示IMP3對于滋養細胞腫瘤的病情評估預后觀察可能有指導意義。HM是滋養細胞的異常增殖所形成，可對子宮肌層和血管發生侵襲，甚至遠處轉移。滋養細胞具有取代血管內皮細胞形成血管內壁的親血管性特點，因此該類腫瘤極易侵蝕子宮肌層血管，并在疾病早期即可發生血行轉移至身體其他臟器。IMP3與胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors，IGFs)結合可以調節IGFs與IGF2型受體間的相互作用，改變其促有絲分裂效應、凋亡抑制效應和促細胞運動的作用[6-7]。Bae等[8]研究發現，IGF-2可以促進腫瘤血管和淋巴管的生長，降低IGF-2信使RNA結合蛋白IGF-2的分泌，可以減少體外腫瘤細胞的增殖和活體腫瘤的生長。因此，IGF2 BP3/IGF-2途徑在HM發生侵蝕和轉移方面可能起到一定的作用。

IHM繼發于HM之后，是一種妊娠滋養細胞腫瘤，臨床表現為惡性病變且多伴有局部侵襲和遠處轉移，需要化療，絕大部分病例均可通過大劑量化療達到治愈，是少數可以治愈的實體腫瘤之一，但部分病例需要化療聯合手術或放射治療等輔助治療手段。滋養細胞疾病的原發灶在子宮，主要通過血行轉移，宮旁血管常異常充盈怒張，血管內常有瘤栓存在，甚至可見到水泡狀組織。有學者報道，對無生育要求的耐藥患者采用化療聯合手術治療的方案，既可縮短治療時間，還可減少復發的風險。對經過多療程化療后血清β-hCG值下降不明顯，而其他部位轉移灶明顯吸收的患者，如懷疑子宮病灶耐藥亦可在更改化療方案的同時進行子宮切除術，以改善治療效果，提高腫瘤緩解率。妊娠滋養細胞腫瘤盆腔血供豐富，易出血及發生癌細胞擴散，并有肺血管栓塞可能，除急診情況為搶救患者生命外，對有手術切除子宮指征的患者，術前應先進行數個療程的化療。大量資料證實，預防性化療可以使IHM的發生率下降近一半，應對有惡變高危因素的HM患者給予預防性化療[9]。

妊娠滋養細胞腫瘤患者行子宮切除手術的適應證為：①年齡大，不希望再生育者，在短期化療后行子宮切除術；②盡量使病灶局限，以減少術中出血，并徹底清除病灶；③子宮病灶已耐藥者行子宮切除術；④子宮破裂者行子宮切除術，對無生育要求的患者采用化療聯合手術治療的方案，既可縮短治療時間，還可減少復發的風險。

對有手術切除子宮指征的患者術前應先進行數個療程化療，待病變基本控制穩定后再行手術，這樣不僅能保證手術過程順利，術中出血少，而且手術也能更為徹底[10]。對于年齡＞40歲的婦女，由于生理機能的特點，妊娠后發生IHM及惡變率的概率較年輕育齡婦女明顯增加，對其的身心健康和生命危害極大，亦極易引起誤診，使患者不能得到及時治療而影響其預后[11-12]。研究發現，IMP3可以介導激活IGF-2的翻譯而促進人類白血病細胞的增殖，IMP3還可以通過和靶信使RNA結合來調整信使RNA的轉移、粘附和運輸，化學藥物抑制了滋養細胞的增殖，從而使IMP3的表達下降，通過與靶信使RNA結合的IMP3蛋白減少來抑制腫瘤信使RNA的轉移、粘附和運輸，從而使滋養細胞的數量減少和活性降低[13]。

有文獻報道，惡性滋養細胞疾病患者的血清HCG分泌量與癌細胞總數以及病情嚴重程度呈正相關[14]。因此，在對實施手術后的滋養細胞腫瘤患者應繼續化療數個療程，以進一步殺死和滅活潛藏于病灶內的滋養細胞，以達到治愈和防止腫瘤復發的目的。滋養細胞疾病患者多數可治愈，病死率明顯降低，但其可發生局部侵襲和遠處轉移，具有降低細胞粘連、對細胞外基質的降解等多數腫瘤的分子生物學特征。Findeis-Hosey等[15]研究報道，IMP3可調節細胞外基質和細胞粘連蛋白，穩定粘附因子CD44及信使RNA從而促進神經癌細胞的形成。

妊娠滋養細胞疾病具有極強的親血管性，在其發生與轉移過程中，必須多次溶解血管內皮基底膜及細胞外基質，來促進細胞惡變及轉移的發生。在妊娠早期，即胚泡和胎盤形成時期，滋養細胞表達和分泌較多的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)，分解細胞外基質(extracellular matrix，ECM)，啟動滋養層粘附、遷移和分化，使滋養層穿透基底膜到達母體循環，促進胚胎種植[16]。而滋養細胞腫瘤的滋養細胞則失去控制，不斷浸潤溶解子宮內膜基質，從而進一步惡化及轉移。因此，在后續研究中可通過檢測血液中IMP3的表達情況進一步研究IMP3在滋養細胞腫瘤及其他婦科腫瘤中的情況，使其成為簡便實用的腫瘤標志物，有利于了解腫瘤的發生、發展及疾病的診療和預后觀察。

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