氫譜磁共振代謝組學在2型糖尿病特征代謝物監測中的應用

張志軍 馬 紅 董繼揚

(廈門大學附屬中山醫院干部保健科，福建 廈門 361004)

2型糖尿病(T2DM)起病隱匿、進展緩慢，往往出現相關癥狀的時候，已經發展到中期甚至晚期，給家庭和社會帶來沉重的負擔。T2DM是多因素參與的整體代謝性紊亂，其調控機制十分復雜。以前的研究主要是利用分子生物學和生物化學等方法，通過檢測單個或少數幾個成分的變化來獲得疾病的相關信息，忽略了整體器官中動態的代謝變化，很難了解體內的整體紊亂，也無法做到對疾病的早期預警。代謝組學技術主要提取生物體液(如尿液、血液)或組織中分子量小于1 000 kD的小分子代謝物信息，揭示系統關聯生物標記物的綜合差異，可以從整體上全面分析疾病對生物系統的影響，能夠為糖尿病(DM)的代謝研究提供良好的技術平臺。磁共振(NMR)技術作為一種非侵入和高效的檢測手段，是代謝組學普遍采用的方法，廣泛應用于生物體液的研究。本文將基于1H-NMR的代謝組學方法應用于T2DM尿液特征代謝物的尋找。

1 對象與方法

1.1研究對象 T2DM組：廈門大學附屬中山醫院內分泌科2012～2013年住院患者98例，平均年齡(58.58±8.69)歲，符合1999年世界衛生組織(WHO)T2DM診斷標準，血清谷氨酸脫羧酶(GAD)抗體檢測均為陰性；排除急性感染、嚴重營養不良、腫瘤、家族性遺傳性疾病等。健康對照組：廈門大學附屬中山醫院體檢中心2012～2013年健康志愿者82例，平均年齡(55.34±9.54)歲，血、尿常規、生化檢查均無明顯異常。所有參與本試驗的志愿者同意參與本研究，被告知本試驗的目的及意義，并簽署知情同意書。

1.2樣品采集 收集研究對象清晨中段尿液3 ml，收集后1 h內經臺式超速離心機以3 000 r/min離心10 min，取上清液0.6 ml，放入-80℃冰箱儲存，1個月內完成實驗。

1.3NMR制譜 進行NMR實驗時，解凍尿液樣品至常溫，取樣品500 μl與250 μl磷酸鹽緩沖液混合，以消除pH變化對化學位移的影響，加入適量的2，2-二甲基-2-硅烷-5-磺酸鈉(DSS)作為化學位移零點的定標，用5 mm樣品管，在Varian NMR System 5 000 MHz譜儀上采集樣品1H NMR譜。實驗采用5 mm HCN三共振探頭，溫度300 K，譜寬5 kHz，信號累加128次，用NOEPR采樣并抑制水峰信號。

1.4數據預處理 采用MestRe-C 2.3軟件及自編程軟件對譜圖的手工相位調節、基線校正和譜峰對齊。并將δ 4.5～δ 6的譜峰強度置為零，截取化學位移δ 0.7～δ 9區間，以消除殘留水信號對分析結果的影響。為了減少噪聲和化學位移漂移的影響，采用自適應分段積分的方法，通過分段積分，得到1個觀測數據矩陣。最后將數據矩陣進行歸一化和標準化，采用sup-PQN面歸一化，歸一后再用Pareto進行列歸一，應用主成分分析(PCA)方法刪除得分圖上明顯不符合的離群點，進行多元統計分析。

1.5統計學方法 將預處理結果導入MATLAB平臺進行多元統計分析。采用PLS-DA進行判別分析及t檢驗。

2 結 果

2.1NMR譜圖分析 根據相應的化學位移和波譜形態，可以得到尿液中主要代謝物成分信息如下：異亮氨酸(δ 0.85)、甲基丙二酸(MMA，δ 1.18)、乳酸(δ 1.33)、丙氨酸(δ 1.48)、亮氨酸(δ 1.75)、檸檬酸(δ 2.56，2.72)、二甲胺(DMA，δ 2.73)、三甲胺(TMA，δ 2.92)、肌酐(δ 3.05，4.05)、甜菜堿(δ 3.27)、氮氧三甲胺(TMAO，δ 3.27)、葡萄糖(δ 3.2～δ 4.0)等。T2DM組和健康對照組尿液中葡萄糖、氮氧三甲胺、檸檬酸水平差異有統計學意義(P<0.05)，其他代謝物的濃度變化很難識別，并且由于存在個體差異，單個樣本的代謝物差異不足以代表全部樣本。

2.2T2DM和健康對照組尿液代謝產物的PLS-DA分析 通過PLS-DA的模式識別分析方法，可以明顯地將T2DM及健康對照組區分開。相對于健康對照組，T2DM組的樣本分布比較分散，這是由于T2DM組的代謝產物個體差異較大造成的。在負載圖中，葡萄糖、乳酸、乙酸的特征變量偏離負載圖中心點最遠，說明這三種成分是引起T2DM組和健康對照組類別差異的重要參數。除了以上3種成分，其他遠離中心點的化學位移對負載圖也有突出貢獻，這說明導致兩組樣本類別差異的代謝物還包含了其他特征代謝物。根據負載圖中的特征變量，我們得到了T2DM尿液中的特征代謝物，經過t檢驗后，T2DM與健康對照組尿液代謝產物比較，乙酸、乳酸、牛磺酸、乙酰乙酸、葡萄糖、丙氨酸、甲基丙二酸含量升高，肌酐、檸檬酸、三甲胺含量降低，差異均有統計學意義(P<0.005)。

3 討 論

代謝組學是繼基因組學和蛋白質組學之后發展起來的一門新興學科，也是系統生物學的重要組成部分。可實現對代謝物全面、實時、系統的輪廓分析，并且可對代謝物因飲食、生活方式、服藥等影響而發生的變化進行描述和評估。實驗中，由于T2DM患者存在糖代謝障礙，使丙酮酸氧化障礙，無法完全進入三羧酸循環，在細胞液中堆積，導致乳酸升高。T2DM患者普遍存在微循環障礙，細胞供氧不良，乳酸脫氫氧化成丙酮酸的過程被抑制，也是造成T2DM患者體內乳酸升高的原因。乳酸性酸中毒死亡率高，預后較差，所以對T2DM患者血液乳酸水平的檢測顯得尤為重要。國外研究報道，乳酸在人體內存在兩種立體異構體，L-乳酸和D-乳酸，D-乳酸含量較少，但其神經毒性遠大于L-乳酸，應當將D-乳酸作為單獨的檢測項目〔1〕。T2DM患者體內D-乳酸含量幾乎為正常人的2倍，其原因目前認為是機體在高血糖狀態下，由升高的丙酮醛轉化而來。文獻指出丙酮醛加劇了機體組織的氧化應激和糖基化過程，促進了糖基化終末產物的形成，從而加速T2DM微血管并發癥和周圍神經病變的進程〔2〕。作為丙酮醛的終末產物，D-乳酸可以作為其體內水平的參考。在臨床上開展針對D-乳酸的檢測，并深入探尋它在T2DM微血管及神經病變中的貢獻，可以作為今后研究的一個方向。

相關研究發現牛磺酸具有影響糖代謝，降低血糖的作用〔3〕。國外學者對其降糖作用進行深入研究，機制主要涉及增加胰島素的敏感性〔4〕，減少胃腸道葡萄糖的吸收〔5〕，促進外周組織對葡萄糖的利用〔6〕。此外Winiarska等〔7〕研究指出，牛磺酸可能通過抑制糖異生來達到降血糖的作用，同時發現，牛磺酸同時具有抗氧化和保護神經的作用，對T2DM并發癥的預防和控制有一定作用。在本研究中，T2DM患者尿液中牛磺酸的水平升高，綜合相關文獻研究結果，我們考慮牛磺酸的排泄增加、體內牛磺酸水平的相對不足，可能在一定程度上參與了T2DM的發生發展。

本研究中T2DM患者尿液中的甲基丙二酸的水平升高，原因可能為：①T2DM患者體內氨基酸及脂肪的代謝異常。②T2DM患者體內維生素B12不足。有文獻報道T2DM患者常用的二甲雙胍、羅格列酮等藥物會導致維生素B12缺乏〔8〕，本研究中T2DM患者服用二甲雙胍的比例較高，我們認為這是尿液中甲基丙二酸水平增加的主要原因。美國的一項META研究指出，維生素B12、MMA的異常會增加多發性神經病變的危險性〔9〕，國內研究也表明，在T2DM患者中，維生素B12水平降低會增加T2DM患者周圍神經病變的發生率〔10〕。臨床上二甲雙胍相關性的VitB12缺乏一直被忽略，早期的VitB12缺乏無典型的臨床表現，但已經存在潛在神經系統損害〔11〕。MMA對維生素B12的早期缺乏較敏感，且MMA由腎臟排泄，尿液中含量較高，所以尿液中的MMA水平敏感地反映維生素B12的缺乏。對于長期應用二甲雙胍的患者，定期監測尿液MMA的水平，預防T2DM周圍神經病變的發生發展，具有一定指導意義。研究表明，多進食富含檸檬酸的食物，能夠限制體內糖基化終末產物的形成，從而延緩T2DM血管病變的進程〔12〕。本研究發現T2DM患者尿液中檸檬酸的水平下降，這可能也是引起微血管病變的因素。

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