Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1 mRNA在神經膠質瘤中表達及臨床意義

王春輝 劉乃杰 谷潔冰 唐 棟 韓雪梅 王立波

(吉林省人民醫院神經外科，吉林 長春 130021)

長期氧化應激與包括神經膠質瘤等多種疾病的發生高度相關〔1～3〕。Kelch樣環氧氯丙烷(ECH)相關蛋白(Keap)1-核因子E2相關因子(Nrf)2/抗氧化反應元件(ARE)是目前發現的最重要抗氧化應激通路之一，在維持機體氧化-抗氧化生理平衡和防御氧化損傷等方面發揮著極為重要的作用〔4〕。Keap1和Nrf2作為氧化應激的關鍵調節者，在神經膠質瘤中的表達值得關注。Nrf2在神經膠質瘤中呈差異性表達，并與腫瘤分級及生存期等臨床特征相關〔5,6〕。然而，Keap1 mRNA在神經膠質瘤中的表達變化未見文獻報道。本研究通過實時熒光定量PCR的方法對神經膠質瘤中Keap1 mRNA進行定量檢測，并分析其與臨床病理分級的相關性，以探討Keap1 mRNA的表達在神經膠質瘤發生發展的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集吉林省人民醫院神經外科神經膠質瘤手術患者43例，男25例，女18例，平均年齡(53.7±16.2)歲，中位年齡54歲。手術標本均經組織病理學確診，置于凍存管中，加入RNA保存液浸泡組織，液氮速凍，-80℃冰箱保存。樣本臨床病理分級：Ⅰ～Ⅱ級25例，Ⅲ～Ⅳ級18例。31例對照標本來源于顱腦外傷減壓術患者，男18例，女13例，平均年齡(53.1±11.3)歲，中位年齡54歲。兩組年齡、性別構成差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2主要儀器及試劑 超微量紫外分光光度計(NANODROP公司，美國)，ABI7500 實時熒光定量PCR儀(ABI公司，美國)。TRNzol總RNA提取試劑、反轉錄試劑盒和SYBR Green(天根公司，北京)。

1.3引物設計 根據NCBI GenBank數據庫公布的人類Keap1 mRNA全長序列(登錄號：NM_012289)，采用Primer3軟件設計引物：Keap1上游:5′-CCAACCGACAACCAAGACC-3′,下游5′-CTCAGTGGAGGCGTACATCA-3′。β-actin上游：5′-CCCAGCCATGTACGTTG CTAT-3′，下游：5′-TCACCGGAGTCCATCACGAT-3′。引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。

1.4實時熒光定量PCR檢測 取出組織，稱重50 mg，勻漿機勻漿，加入1 ml TRNzol，按照操作說明提取RNA，超微量紫外分光光度計檢測RNA純度和濃度。運用隨機引物和M-MLV反轉錄酶將500 ng RNA反轉錄成cDNA。建立定量PCR反應體系：2×SYBR Green 10 μl，cDNA 2 μl，上游和下游引物(10 μmol/L)各0.2 μl，加無RNA酶水至20 μl。ABI7500 實時熒光定量PCR儀上進行反應，反應條件如下：95℃預變性1 min，95℃ 5 s，60℃ 30 s， 40個循環后95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s進行熔解曲線分析。每個樣本3個復孔，以β-actin作為內參，采用2-ΔCt法分析樣本中Keap1 mRNA相對含量。

1.5統計學方法 采用SPSS11.0統計軟件進行t檢驗。

2 結 果

熔解曲線波形一致，波峰單一銳利，無非特異性波峰出現，表明引物較好，無非特異性擴增，結果可靠。神經膠質瘤組中Keap1 mRNA表達量(0.59±0.64)顯著低于對照組(1.09±0.93；t=2.57，P=0.01)。神經膠質瘤Ⅲ～Ⅳ級Keap1 mRNA表達量(0.37±0.32)顯著低于Ⅰ～Ⅱ級(0.75±0.77；t=2.20，P=0.04)。Keap1 mRNA表達水平與神經膠質瘤患者年齡(≥44歲，n=23，0.53±0.45；<44歲，n=20，0.67±0.82)和性別(男0.56±0.59，女0.64±0.72)無明顯相關性(t=-0.68，P=0.50;t=-0.39,P=0.70)。

3 討 論

氧化應激是指在遭受各種外界有害刺激時，機體內產生大量氧化中間產物，如活性氧自由基和活性氮自由基，超出清除能力，氧化系統和抗氧化系統失衡，導致組織器官損傷〔4,7〕。Nrf2是機體抗氧化應激過程中的重要轉錄因子，生理狀態下，Nrf2位于細胞質內，與接頭蛋白Keap1結合形成異二聚體，使Nrf2被迅速降解。應激狀態下，Nrf2與Keap1解離后轉入細胞核內，通過與ARE相互作用，活化抗氧化酶和蛋白，發揮抗氧化、抗炎和抗腫瘤作用。

Nrf2在神經膠質瘤中高表達，與腫瘤分級和生存期等臨床特征相關〔5,6〕。低表達Nrf2可通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路抑制神經膠質瘤細胞增殖、血管形成，促進細胞凋亡和替莫唑胺誘導的細胞自噬〔8～10〕。探索靶向Nrf2藥物成為研究的新方向，例如，檜醇可通過抑制Nrf2表達減少膠質瘤干細胞自我更新、侵襲、遷移和克隆形成等腫瘤特性，發揮抗腫瘤作用〔11〕。Fan等〔12〕報道，過表達Nrf2或低表達Keap1能夠加快膠質瘤細胞增殖和腫瘤形成，抑制細胞程序性死亡，例如鐵死亡。激活Keap1-Nrf2/ARE信號通路能夠上調胱氨酸谷氨酸轉運蛋白的表達，促進谷氨酸分泌，從而影響腫瘤微環境。全反式視黃酸可通過下調Keap1的表達抑制膠質瘤細胞生長，使細胞周期阻滯于G0/G1期，并增強替莫唑胺誘導的細胞自噬〔13〕。

本研究提示Keap1 mRNA的表達不僅與神經膠質瘤的發病有關，而且與腫瘤惡性程度有關。關于Keap1 mRNA低表達的原因，有研究顯示膠質瘤患者Keap1啟動子區CpG存在高度甲基化，高甲基化患者的無進展生存期更短〔14〕，表明Keap1的表觀遺傳調控可能參與神經膠質瘤的發病，其確切機制有待進一步研究。若探明其分子機制，將有望針對Keap1開發安全有效的藥物治療神經膠質瘤。

1熊珊珊,石英英,石漢平.活性氧與腫瘤研究進展〔J〕.中華腫瘤防治雜志,2014；21(13):1045-8.

2劉曉陽,王立波,侯曉節,等.五味子乙素抑制膠質瘤生長的作用〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(17):4176-7.

3孫桂亮,張承巍,李若文,等.谷氨酸介導三氧化二砷抑制SHG-44膠質瘤細胞增殖〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(23):5934-5.

4胡流芳,王 迎,任汝靜,等.Keap1-Nrf2/ARE信號通路的抗氧化應激作用及其調控機制〔J〕.國際藥學研究雜志,2016；43(1):146-52,166.

5Tsai WC,Hueng DY,Lin CR,etal.Nrf2 expressions correlate with WHO grades in gliomas and meningiomas〔J〕.Int J Mol Sci,2016;17(5):E722-5.

6王 波,張協軍,陳保東,等.不同級別腦膠質瘤細胞中Nrf2、MGMT表達的臨床意義及其相關性分析〔J〕.深圳中西醫結合雜志,2016;26(8):1-4.

7Cai L,Kang YJ.Oxidative stress and diabetic cardiomyopathy:a brief review〔J〕.Cardiovasc Toxicol,2001;1(3):181-93.

8Ji XJ,Chen SH,Zhu L,etal.Knockdown of NF-E2-related factor 2 inhibits the proliferation and growth of U251MG human glioma cells in a mouse xenograft model〔J〕.Oncol Rep,2013;30(1):157-64.

9Zhou Y,Wang HD,Zhu L,etal.Knockdown of Nrf2 enhances autophagy induced by temozolomide in U251 human glioma cell line〔J〕.Oncol Rep,2013;29(1):394-400.

10Jia Y,Wang H,Wang Q,etal.Silencing Nrf2 impairs glioma cell proliferation via AMPK-activated mTOR inhibition〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2016;469(3):665-71.

11Ouyang WC,Liao YW,Chen PN,etal.Hinokitiol suppresses cancer stemness and oncogenicity in glioma stem cells by Nrf2 regulation〔J〕.Cancer Chemother Pharmacol,2017;80(2):411-9.

12Fan Z,Wirth AK,Chen D,etal.Nrf2-Keap1 pathway promotes cell proliferation and diminishes ferroptosis〔J〕.Oncogenesis,2017;6(8):e371.

13Shi L,Li H,Zhan Y.All-trans retinoic acid enhances temozolomide-induced autophagy in human glioma cells U251 via targeting Keap1/Nrf2/ARE signaling pathway〔J〕.Oncol Lett,2017;14(3):2709-14.

14Muscarella LA,Barbano R,D′Angelo V,etal.Regulation of KEAP1 expression by promoter methylation in malignant gliomas and association with patient′s outcome〔J〕.Epigenetics,2011;6(3):317-25.