環狀非編碼RNA在口腔鱗癌中的研究進展

衛佳寧，續國強，高繼萍，宋國華

(山西醫科大學實驗動物中心，實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室，太原 030001)

口腔癌是世界上最常見的第十一種惡性腫瘤，尤其是在發展中國家，在發病總數中排名第九[1]。雖然隨著醫學技術的發展，口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)的死亡率保持相對不變。但統計發現口腔癌患者趨于年輕化，該癌癥的總體預后較差，生存率約55%～65%[2]。這可能是由于延遲診斷，早期診斷是降低口腔癌死亡率的關鍵，目前尋找一種新的生物標志物和治療目標是至關重要的。環狀RNA(circular RNA，circRNA)在哺乳動物中廣泛存在[3]，通過共價鍵連接3’和5’末端形成閉合環狀結構的內源性非編碼RNA[4]，因其閉環結構能夠抗核糖核酸酶的降解，在細胞和組織的發育階段能夠穩定的表達[5]。一些研究發現，circRNA可參與RNA蛋白復合物的形成和RNA-RNA調控網絡[6]，可作為一個病毒或病毒復制的模板，在RNA加工反應中作為順式作用元件起作用，如snoRNA基因和miRNA海綿[7]。研究表明，circRNA參與一些疾病的發生發展[8]，尤其在腫瘤方面。因此，從circRNA角度研究口腔鱗癌致病機理及治療方案具有重要意義。

1 CircRNA的生物合成、分類及作用機制

1.1 CircRNA的生物合成

CircRNA是前體mRNA(pre-mRNA)通過可變剪切加工產生，廣泛且穩定地存在于所有的真核生物中的一類非編碼RNA[9-10]。大部分的circRNA是由外顯子序列構成，在不同的物種中具有保守性，同時存在組織及不同發育階段的表達特異性。CircRNA也可以通過非經典剪接方式進行反向剪接形成。2013年，Jeck等[5]在《RNA》中提出circRNA產生的兩種模型：套索驅動環化和內含子驅動環化。套索驅動環化模型認為pre-mRNA的轉錄過程中由于RNA發生了部分折疊，拉近了原本非相鄰的外顯子，從而發生了外顯子跳躍，使得被跨越的區域形成了環形RNA中間體，進一步通過套索剪接形成由外顯子構成的環形RNA分子。另一種模型認為，內含子區域的反向互補序列導致內含子區域配對，介導反向剪接，從而形成環形RNA分子[11]。

1.2 CircRNA的分類

環狀RNA的產生多種多樣，可來源于不同的基因，也可由同一基因產生。根據來源可以分為3類：存在于細胞質中僅由外顯子構成的環狀RNA(exonic circRNA)；置于細胞核中僅由內含子構成的環狀RNA(intronic circRNA)[12]；包含外顯子之間的內含子的circRNA(exon-intro circRNA)[13]。

1.3 CircRNA的作用機制

CircRNA最初被認為是mRNA拼接錯誤的副產品，具有穩定、多樣化和保守的特點。近期研究顯示，circRNA在不同物種中起到miRNA“分子海綿”的作用，稱之為競爭性內源RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)，能競爭性結合疾病相關的miRNA，解除miRNA對其靶基因的抑制作用，上調靶基因的表達水平，從而在疾病調控中發揮重要作用。CircDOCK1通過作為ceRNA調節BIRC3表達并參與OSCC細胞凋亡的過程[14]。Circ_100290通過充當miR-29的“分子海綿”在口腔癌中發揮作用[15]。CircHIPK3作為miR-124海綿，調節靶標水通道蛋白3(AQP-3)表達，AQP-3進而促進細胞增殖和遷移[16]。CircRNA也可與lncRNA競爭性結合miRNA。Li等[17]通過GO分析和KEGG分析發現，在生殖干細胞中lncRNA Meg3和cirRNA Igf1r可以與miRNA-15a-5p競爭結合增加靶基因InhA、ACSL3、KIF21B和IGFBP2的表達。這些發現為lncRNAs和circRNAs提供了新的視角，為將來對生殖干細胞中lncRNAs和circRNAs調控機制的研究奠定了基礎。

2 CircRNA與口腔鱗癌

2.1 口腔鱗癌中充當miRNA海綿作用

CircRNA可以與miRNA結合，從而阻止miRNA沉默，因此circRNA也稱miRNA海綿[18-19]。有研究表明[3, 7, 14-15]，circRNA_100290、circDOCK1、circRNA BANP和circRNA ITCH在口腔癌中通過miRNA的海綿參與發病機制。

2.1.1 CircRNA_100290

Chen等[15]使用微陣列分析對OSCC中的circRNA進行了全面研究，鑒定出在OSCC組織和非癌組織之間差異表達的circRNAs，發現circ_100290在OSCC發展中起著重要的調節作用。CircRNA_100290在口腔癌組織中表達上調，通過充當miR-29家族成員的“分子海綿”來調節基因表達。CircRNA_100290與OSCC細胞在體外和體內的增殖相關。他們還發現circRNA_100290在OSCC組織中上調并與CDK6共表達。通過使用circRNA_100290特異性小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)敲低circRNA_100290的表達水平，檢測OSCC細胞系中G1/S期阻滯，抑制細胞增殖并降低CDK6的表達。通過熒光素酶報告基因檢測，觀察到circRNA_100290直接與miR-29家族成員結合，包括miR-29a、miR-29b和miR-29c。進一步EGFP/RFP報告分析顯示CDK6是miR-29b的直接靶標。總之，circRNA_100290可能作為ceRNA通過抑制miR-29b家族成員來調節CDK6表達。這表明circRNA可能在OSCC中發揮調節功能，可作為OSCC治療的潛在靶點。進一步的研究顯示circRNA_100290通過攜帶miR-29家族成員來發揮其調控功能，以減少CDK6的表達，CDK6也直接被miR-29家族靶向。它表明circRNA_100290和CDK6 mRNA是由miR29家族連接的一對ceRNA。

2.1.2 CircDOCK1

CircDOCK1為環狀RNA鳥苷酸交換因子，先前有研究顯示[20]通過TGF-β處理，circDOCK1的表達降低，而circDOCK1的靶基因mRNA表達增加2倍。此外TGF-β處理可以誘導上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)，表明circDOCK1的功能之一可以誘導上皮細胞mRNA下調，從而保持細胞穩定性。Wang等[14]通過用TNF-α刺激CAL-27細胞建立凋亡模型，使用高通量微陣列從細胞凋亡模型和正常CAL-27細胞中獲得差異表達的circRNA譜，發現has_circ_100721(circDOCK1)過表達并且敲低circDOCK1表達水平可導致細胞凋亡率的增加。他們利用多種生物信息學方法，預測了circRNA、miRNA和基因之間的相互作用，并構建了circDOCK1/miR-196a-5p/BIRC3網絡，確定circDOCK1與miR-196a-5p通過與BIRC3競爭，最終調節細胞凋亡而相互作用。用siRNA沉默circDOCK1和模擬物上調miR-196a-5p的表達，導致OSCC細胞中細胞凋亡增加并減少BIRC3形成，并通過qRT-PCR方法比較口腔鱗狀細胞癌組織及癌旁組織中的circDOCK1，miR-196a-5p和BIRC3的表達進一步證實了此結果。最后得出結論，circDOCK1通過在OSCC中靶向BIRC3抑制miR-196a-5p來抑制細胞凋亡。

2.1.3 CircRNA BANP和circRNA ITCH

研究人員一直在探索控制牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSC)成骨分化的分子機制。研究表明，circRNA參與成骨分化[3, 7]。CircRNA BANP和circRNA ITCH分別為環狀RNA酸性神經肽和環狀RNA泛素連接蛋白。CircRNA BANP和circRNA ITCH可能與miRNA-34a和miRNA-146a相互作用以通過MAPK途徑調節PDLSC成骨分化。雖然有數種lncRNAs、circRNAs和miRNAs被認為參與了PDLSC成骨分化，但是關于它們潛在的網絡和功能的數據并不多。為了充分了解ceRNA對PDLSC成骨分化的影響，整合lncRNA/circRNA-miRNA-mRNA競爭性調控網絡至關重要。利用Illumina HiSeq2000開發RNA測序(RNA-seq)，以全面鑒定正常和成骨誘導性PDLSCs中差異表達的lncRNA和circRNA。使用qRT-PCR進一步證實了代表性的lncRNA和circRNA。最后，基于miRanda預測了lncRNA、circRNA、miRNA和mRNA的ceRNA網絡，并通過GO分析和KEGG分析研究了它們的潛在調控作用。CeRNA網絡表明，TCONS_00212979、TCONS_00212984、circRNA BANP和circRNA ITCH可能與miRNA-34a和miRNA-146a相互作用以通過MAPK途徑調節PDLSC成骨分化[21]。研究結果可能為探索PDLSC成骨分化的分子機制提供新的證據。

2.2 轉錄調節作用

Li等[22]研究發現，在人類HeLa細胞中存在與RNA聚合酶II相關的circRNAs。在這些circRNA中，外顯子被環化，內含子在外顯子之間“保留”，可稱它們為外顯子-內含子circRNA或EIciRNA(exon-intron circRNA)。EIciRNA主要定位于核內，與U1 snRNP相互作用并促進其親本基因的轉錄。他們的研究結果揭示了circRNA在調節細胞核中基因表達中的新作用，其中EIciRNAs增強其順式的親本基因表達，并突出了通過U1 snRNA和EIciRNAs之間的特定RNA-RNA相互作用進行轉錄控制的調控策略[22]。

2.3 生物標志物

據報道，circRNA BANP和circRNA ITCH有助于致癌并可能作為癌癥生物標志物[23-24]。CircRNA_100290作為miR-29家族成員的海綿起作用，在口腔癌中起到CDK6的ceRNA的作用[15]，circDOCK1通過作為ceRNA調節BIRC3表達并參與OSCC細胞凋亡的過程[13]。因此，circRNA_100290和circDOCK1可能成為OSCC的新型潛在生物標志物和治療靶點。CircRNA參與多種病理狀態，包括神經系統疾病[25-26]、血液病[27]、軟骨退化[28]、先天性巨結腸病[29]和多種癌癥，這可以作為有前途的診斷生物標志物和治療靶點。與miRNA和lncRNA相比，circRNA具有序列保守性，生物學穩定性和組織特異性特點，因此circRNA被認為是有希望的生物標志物和治療靶點，并且可能在基因表達的調節中發揮潛在的功能。

3 展望

近幾年來，circRNA具有充當miRNA分子“分子海綿”、調控基因轉錄、與蛋白質相互作用、吸附蛋白質以及參與蛋白質的翻譯等功能，且能穩定存在于血清等特性。雖然目前對circRNA的研究并不是很多，但隨著RNA測序技術的迅速發展，circRNA這個未來之星在口腔鱗癌的診斷和預后治療方面有很大的發展前景。從circRNA入手挖掘新的生物標志物及circRNA在口腔中的潛在功能有助于口腔癌的早發現、早治療。目前部分circRNA已被證實與腫瘤的發生、侵襲、轉移和患者的預后相關。隨著生物信息學方法及實驗技術手段不斷成熟，大數據分析的廣泛應用，挖掘新數據、篩選具有生物標記的circRNA、結合circRNA-miRNA-mRNA機制及circRNA-lncRNA-mRNA機制分析疾病通路對于研究口腔鱗癌發生發展進程具有廣闊的發展前景。