黃芪多糖的氧化降解及其抗氧化和抗腫瘤活性研究

鄧六勤，黎梅桂，吳寶儀

(廣東省廣州市婦女兒童醫療中心，廣東廣州510000)

黃芪為豆科植物膜莢黃芪、蒙古黃芪、多序巖黃芪或紅芪的干燥根，味甘，性微溫，具有補氣固表、利水退腫、脫毒排膿、生肌等功效[1]?，F代藥理研究表明，黃芪具有調節免疫、增強體質、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤及改善心肌缺血等功能[2－4]。黃芪的主要化學成分有黃酮類、皂苷類、黃芪多糖、氨基酸等[5]，黃芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）是黃芪中最主要的活性成分[6]，具有增強機體抵抗力，促進抗體生成，增強免疫力，雙向調節血糖和保護心血管系統等作用[7－8]，目前廣泛用于中醫臨床制劑和動物飼料[9]。黃芪多糖的組成較復雜，其相對分子質量為10～50 kD[10]。黃芪多糖具有一定的生物學活性，但由于其相對分子質量大，溶解性差，不易被吸收，故在應用方面受到很大限制。李紅法等[11]采用乙醇分級沉淀法提取黃芪多糖，獲得了不同相對分子質量的黃芪多糖，表明隨著黃芪多糖相對分子質量的降低，抗氧化活性增強。故采用適宜的方法將黃芪多糖相對分子質量降低，有助于提高其生物活性。本研究中采用維生素C（Vit C）和過氧化氫體系誘導產生的自由基降解黃芪多糖，制備低相對分子質量黃芪多糖，并研究其抗氧化、抗腫瘤活性，為探討低相對分子質量黃芪多糖在抗腫瘤藥物和保健食品中的應用提供試驗依據?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：T1000型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；HWS24型電熱恒溫水浴鍋（上海－恒科技有限公司）；Eyela N－1100型旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）；OSB－2100型油浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）；SHB－3型循環水多用真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；CO2細胞培養箱；顯微鏡；酶標儀（Bio－Rad Inc.USA）。

試藥：FeCl2·4H2O（天津市大茂化學廠，批號為20151220）；H2O2（天津市大茂化學廠，批號為20160720）；水楊酸（天津市致遠化學試劑有限公司，批號為20150208）；鄰苯三酚（天津市致遠化學試劑有限公司，批號為20160315）。以上試劑均為分析純。去離子水(實驗室自制)；黃芪購買于清平中藥材市場，經鄧六勤副主任中藥師鑒定為中藥黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge。藥材打粉后，過4號篩，備用。

1.2 方法

1.2.1 鐵皮石斛粗多糖的提取分離

取黃芪粉末約100 g，精密稱定，用石油醚回流提取2 h，過濾，棄去濾液，濾渣重新用80%乙醇回流提取2 h，除去可溶性雜質，包括色素、游離糖等。處理后的黃芪粉末加入去離子水，回流提取2 h，連續提取3次，合并濾液。合并的濾液以4 000 r／min的速率離心10 min。減壓濃縮上清液，濃縮液加入4倍體積的無水乙醇，低溫冷藏，靜置過夜。離心，沉淀置60℃的烘箱中烘干。用熱水溶解烘干的粗多糖，用Sveag法脫蛋白，重復3～5次。脫蛋白后的多糖用無水乙醇沉淀，靜置過夜，離心，60℃烘干，得到黃芪粗多糖。

1.2.2 H2O2－Vit C－Fe2＋氧化降解粗多糖的提取

稱取1.2.1項下得到的粗多糖3.2 g，置500 mL錐形瓶中，加320 mL純水使其溶解，加入新鮮配制的不同量的100 mmol的Vit C，1 000 mmol的FeCl2·4H2O，1 000 mmol H2O2，置暗處反應2 h。然后將反應液置于300Da透析袋中，在純水中透析2 d，透析液以7000r／min的速率離心10 min，冷凍干燥上清液，得不同降解片段的粗多糖。

1.2.3 多糖相對分子質量測定

黃芪多糖降解片段樣品及標準多糖Dextran standard系列樣品分別經高效液相凝膠滲透色譜(HPGPC)分析，所用儀器為Agilent 1100 series型高效液相色譜（HPLC）主機，配置示差折光檢測器，分析柱為TSK G4000PWXL（300 mm×7.5 mm）和TSK G5000PWXL（300 mm×7.8 mm）串聯柱樣品質量濃度為1.5 g／L；進樣量為20 μL；流動相為醋酸鈉；檢測器靈敏度為4；柱溫為40℃；流速為0.6 mL／min。葡聚糖標準品(相對分子質量1 270，5 220，11 600，23 800，48 600，80 900，147 600，273 000，409 800，667 800)建立標準曲線。

1.2.4 抗氧化活性測定

對O2·的清除作用：取5 g／L的多糖樣品溶液50 μL，125 μL Tris緩沖液，25 μL鄰苯三酚，迅速混勻，于325 nm波長下測定吸光度(A)，每30 s測1次，連續測5 min，以水代替樣品測A0，ΔA為線性回歸方程的回歸系數。清除率＝（1－ΔA／ΔA0）×100%。

對·OH的清除作用：取2 mL不同質量濃度（0.5，1，2，3，5 g／L）的多糖樣品與2 mL 6 mmol／L FeSO4，2 mL 2.4 mmol／L H2O2混合，搖勻，靜置10 min，再加入6 mmol／L的水楊酸2 mL，搖勻，37℃水浴30 min，4 000 r／min離心10 min，上清液于510 nm波長處測定Ai，用1 mL水代替樣品測定A0，用2 mL水代替H2O2溶液測定Aj。清除率＝[1－(Ai－Aj)]／A0×100%。

1.2.5 體外抗腫瘤活性測定

細胞株及培養條件：人肝癌細胞株HepG－2常規培養于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，37℃，5%CO2，培養箱中培養，3 d換液1次，取對數生長期細胞用于試驗。

MTT法檢測細胞生長抑制率：細胞以5×104／孔接種于96孔板，置37℃、5%CO2的培養箱中，次日細胞貼壁后棄去培養液，加入質量濃度為10，25，50，100，400 μg／mL的黃芪多糖培養液100 μL，每個質量濃度設5孔，同時設無藥陰性對照組5孔，以及陽性對照組5－氟尿嘧啶（5－FU），質量濃度為100 μg／mL，設5孔；然后置37℃、5%CO2培養箱繼續培養24，36，48 h；取出后加入5 g／L的MTT溶液20 μL，37℃避光繼續培養4 h；每孔加二甲基亞砜（DMSO）150 μL，震蕩10 min，混勻使甲瓚結晶充分溶解；置酶標儀490 nm波長下檢測各孔吸光度(OD)，取5個復孔的均值為最終結果；計算細胞抑制率，細胞抑制率＝(陰性對照組OD值－多糖組OD值)／陰性對照組OD值×100%。

2 結果

2.1 氧化降解

黃芪粗多糖用不同質量濃度的H2O2－Vit C－Fe2＋氧化降解后，共得到6個降解片段，冷凍干燥后稱定質量。不同相對分子質量多糖片段的降解方法和得率見表1。

2.2 相對分子質量測定

系列相對分子質量標準品的HPGPC分析保留時間見表2。以保留時間計算各自的分配系數(Kaw)作橫坐標、相對分子質量為縱坐標，線性回歸方程為Y＝－0.3109X＋13.148(R2＝0.994 5)。黃芪粗多糖及其降解片段洗脫峰型對稱，由線性回歸方程及樣品保留時間可計算出黃芪多糖相對分子質量結果為：粗多糖269 459.60 u，片段1為74 446.11 u，片段2為105 006.92 u，片段3為167 793.73 u，片段4為87 565.35 u，片段5為133 226.45 u，片段6為96 574.76 u。

表1 氧化降解因素水平表

表2 標準品的HPGPC分析保留時間

2.3 黃芪多糖體外抗氧化活性研究

2.3.1 對羥基的清除作用

黃芪粗多糖及其降解片段對·OH的清除作用效果見圖1 A。線性范圍為0.5～5.0 g／L，陽性藥Vit C對·OH的清除效果非常明顯，清除率近100.00%。由圖1 A可見，粗多糖和6個降解片段對羥基的清除能力均隨質量濃度的增高而增大，5 g／L片段1清除率已超過60%。降解片段1～6和降解前的粗多糖的半數抑制濃度(IC50)分別為1.669，7.043，12.742，2.428，9.641，2.573 g／L。6個降解片段的清除效果均比粗多糖好，且清除作用1＞4＞6＞5＞2＞3。

2.3.2 對超氧基的清除作用

黃芪粗多糖及其降解片段對O2·的清除作用效果見圖1 B。線性范圍為0.5～5.0 g／L，陽性藥Vit C對O2·的清除效果非常明顯，清除率趨近100.00%。由圖1 B可見，黃芪多糖對O2·的清除作用較弱。黃芪粗多糖降解前對O2·的清除率在質量濃度為5 g／L時為40.1%。降解后的多糖片段清除作用有所增強，片段1在質量濃度為5 g／L時清除率達66.4%。降解片段1，4，6清除作用明顯優于粗多糖，也比片段2，3，5清除效果好?？梢姡?個降解片段的清除效果均比粗多糖好。

2.4 體外抗腫瘤活性

圖1 黃芪粗多糖及其降解片段清除作用

體外抗腫瘤活性采用MTT法評價。陽性對照藥為5－Fu，24，48 h時的抑制率為51.32%和61.47%，檢測正常，可作為比較。黃芪粗多糖及其降解片段1，4，6清除自由基的能力較強，故抗腫瘤活性選擇片段1，4，6作進一步研究。在質量濃度為50～800 μg／mL范圍內處理HepG－2，分別于24，48 h時測定對HepG－2的生長抑制作用，細胞存活率見圖2。可見，黃芪多糖對HepG－2的生長抑制存在濃度依賴性，隨著給藥質量濃度的增大，細胞活性降低。

由圖2可見，給藥48 h比給藥24 h時抑制作用強，說明黃芪多糖對HepG－2抑制作用存在時間依賴性。降解片段1對HepG－2抑制作用較突出，24 h時和48 h時的抑制作用均比其他多糖強，48 h時在給藥質量濃度為800 μg／mL時，其抑制率達57%。雖然降解片段6在800 μg／mL時略微低于粗多糖，該給藥質量濃度非常高，但差異不明顯?？梢?，無論是24 h時還是48 h時，各給藥質量濃度下，黃芪多糖降解片段均表現出更好的抗HepG－2活性，高于降解前的粗多糖的活性。

3 討論

圖2 不同濃度的黃芪多糖對HepG－2細胞的抑制效果

多糖是來源于高等植物、動物細胞膜及微生物細胞壁中的一類天然大分子，是構成生命的四大基本物質之一，廣泛參與細胞間信號轉導、細胞分化、再生等各種生命現象?，F代藥理研究表明，多糖具有抗病毒、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、調血脂、增強免疫等生物活性，且來源廣泛，不良反應少，在食品和新藥研發領域已受到越來越多的關注。

目前，國內外學者提出的多糖降解方法主要分為化學降解法、物理降解法和生物降解法[12]。多糖在氧化劑的存在下可進行氧化降解，用H2O2氧化降解多糖無毒，無副產物，是較理想的化學降解方法。王琪琳[13]報道，海帶硫酸多糖可被H2O2有效地降解，降解之后海帶硫酸多糖的多糖含量、硫酸根含量及單糖組成基本無變化。孫利芹等[14]用過氧化氫輔助超聲波降解法制備低相對分子質量紫球藻多糖，研究表明，相對分子質量小的多糖對自由基有明顯的清除作用，相對分子質量對其抗氧化活性有顯著影響。

黃芪的多糖含量超過10%，是其主要成分和活性物質。大分子的黃芪多糖雖具有一定的生物活性，但由于其相對分子質量大，溶解性較差，生物利用率較低，制約了其藥效發揮。研究表明，黃芪多糖的生物活性與其相對分子質量大小相關。文獻[12]報道采用分步醇沉法對黃芪總多糖進行分離，結果顯示，不同相對分子質量黃芪多糖均有抗氧化作用，且抗氧化能力與其相對分子質量大小有關。

本研究中，通過氧化降解，使黃芪多糖相對分子質量降低，得到6個不同相對分子質量的粗多糖片段。由基體外抗氧化試驗表明，黃芪多糖降解后的片段抗氧化活性增強，清除羥基的作用比清除超氧基強。然后，用體外抗氧化活性較強的片段進行體外抗腫瘤研究，結果顯示，降解片段對HepG－2抑制作用比降解前的粗多糖強。

黃芪為補氣佳品[15]，但目前主要作為茶飲或臨床調配使用，極少有深加工的保健產品。本研究中采用氧化降解的方法降解黃芪多糖，為尋找多糖生物活性較強適宜的相對分子質量范圍，提高黃芪的生物利用度，以及為其他中藥材多糖的降解提供參考。同時，本研究中還發現黃芪多糖具有一定抗氧化、抗腫瘤作用，提示其可在防衰老、抗腫瘤等方面發揮作用，進一步擴大了黃芪的藥用范圍，為黃芪多糖精加工提供理論依據，有望開發為藥品或多糖保健品，以提高黃芪的經濟利用價值。

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