假連翹提取物對(duì)胡椒瘟病菌抑菌活性測(cè)定

茍亞峰 孫世偉 高圣風(fēng) 孟倩倩 王政 劉愛(ài)勤

摘 要 測(cè)定假連翹提取物對(duì)胡椒瘟病菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)的抑菌活性及其對(duì)胡椒瘟病的防治效果。結(jié)果表明：10 mg/mL的假連翹提取物對(duì)胡椒瘟病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌率達(dá)到100%，EC50為1.495 1 mg/mL，對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)到62.41%。當(dāng)假連翹提取物稀釋50倍時(shí)，對(duì)盆栽胡椒瘟病的保護(hù)效果達(dá)到77.55%，治療效果較低。可見(jiàn)，假連翹用于防治胡椒瘟病具有較大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

關(guān)鍵詞 假連翹 ；提取物 ；胡椒瘟病菌 ；抑菌活性 ；防治效果

中圖分類號(hào) S567.19 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.09.010

Abstract Antifungal activity of Duranta repens extracts against mycelium growth and spore germination of Phytophthora capsici and its control efficacy were determined. The results showed that when P. capsici was treated with the D. repens extracts at a concentration of 10 mg/mL the mycelium growth of P. capsici was inhibited by 100%， with EC50 being 1.495 1 mg/mL， while the spore germination of P. capsici was inhibited by 62.41%. When the D. repens extracts were diluted by 50 times， and the control efficacy was 77.55%. The D. repens extracts had a high potential in development into a fungicide for control of P. capsici.

Keywords Duranta repens ； extracts ； Phytophthora capsici ； pathogen inhibitory activity ； control efficacy

胡椒瘟病又稱胡椒莖（基）腐病，是由辣椒疫霉（Phytophthora capsici Leonian）侵染引起的一種傳染力很強(qiáng)的土傳性病害，胡椒瘟病一直是威脅胡椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的首要病害[1-2]。在高溫多雨季節(jié)，病情嚴(yán)重的胡椒園損失率達(dá)90%以上[3-4]。國(guó)內(nèi)目前生產(chǎn)上用于防治由Phytophthora capsici引起的疫病主要以甲霜靈、三乙磷酸鋁、敵克松、殺毒礬等化學(xué)藥劑防治為主。由于長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥，不僅容易引起抗藥性，而且容易破壞胡椒園的生態(tài)環(huán)境和降低胡椒的品質(zhì)[5-6]。國(guó)外Demirci[7]測(cè)定了大蒜、薄荷、卷心菜、苜蓿等乙醇提取物對(duì)胡椒瘟病的防治效果，其中，卷心菜乙醇提取物對(duì)大田胡椒瘟病的防效達(dá)到89.5%。Ezziyyani等[8]利用哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和婁徹氏鏈霉菌（Streptomyces rochei）對(duì)胡椒瘟病進(jìn)行了生物防治研究。

前期研究發(fā)現(xiàn)，假連翹（Duranta repens Linn.）、圓滑番荔枝（Annona glabra Linn.）、蔓馬纓丹（Lantana montevidensis Briq.）等乙醇提取物對(duì)胡椒瘟病菌菌絲生長(zhǎng)具有較好的抑菌效果。假連翹為馬鞭草科植物，我國(guó)南方常見(jiàn)栽培或逸為野生，原產(chǎn)熱帶美洲，具有截瘧，活血止痛之功效。目前，假連翹用于防治蟲(chóng)害的研究很多。賴建輝[9]等研究表明，15%煙堿、草提取物和假連翹提取物中含有對(duì)黃曲條跳甲種群明顯起忌避作用的活性物質(zhì)。徐武兵[10]等研究發(fā)現(xiàn)，金葉假連翹對(duì)福壽螺有一定的驅(qū)趕作用。但對(duì)假連翹提取物中具體的生物活性成分還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究進(jìn)一步測(cè)定了假連翹乙醇提取物對(duì)胡椒瘟病菌的抑菌活性，為下一步分離抑制胡椒瘟病菌的活性成分奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

假連翹枝葉采于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所。將新鮮的假連翹枝葉充分陰干，磨碎，過(guò)40目篩后，置通風(fēng)、避光處儲(chǔ)藏，備用。

1.1.2 供試病原菌

胡椒瘟病菌（Phytophthora capsici）從發(fā)病胡椒瘟病葉片中分離得到。

1.2 方法

1.2.1 假連翹提取物的制備

準(zhǔn)確稱取一定量的假連翹枝葉干粉裝入廣口瓶中，加入干粉5倍量的乙醇浸提72 h，并將濾液減壓濃縮，依次重復(fù)3次，合并3次的濃縮液，得假連翹提取物浸膏備用。

1.2.2 假連翹提取物對(duì)胡椒瘟病菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)的影響

參照黃艷飛等[11]操作方法進(jìn)行，將假連翹提取物制備為100和50 mg/mL，以加入等體積萃取溶劑滅菌水的PDA培養(yǎng)平板為對(duì)照，每個(gè)處理做3個(gè)皿重復(fù)。接種后，在人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)，25～28℃下培養(yǎng)5 d，采用十字交叉法分別測(cè)量菌落直徑，求其平均值，計(jì)算提取物對(duì)胡椒瘟病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌率。

將假連翹提取物制備為20和10 mg/mL，將孢子懸浮液與供試的2種濃度按體積比為1∶1的比例混合均勻后，滴加1滴于滅菌的凹玻片上，28℃培養(yǎng)6～12 h，當(dāng)對(duì)照的孢子萌發(fā)率達(dá)到80%以上時(shí)，在顯微鏡下檢查200個(gè)孢子的萌發(fā)情況，計(jì)算提取物對(duì)胡椒瘟病菌孢子萌發(fā)的抑制率。

1.2.3 假連翹提取物對(duì)胡椒瘟病菌毒力（EC50）測(cè)定

將假連翹提取物稀釋為5個(gè)濃度，按一定比例加入到融化好的PDA培養(yǎng)基中，參照1.2.2的方法測(cè)定，每處理重復(fù)3次，用最小二乘法計(jì)算毒力回歸方程及抑制中濃度（EC50）。

1.2.4 假連翹提取物對(duì)活體胡椒瘟病防治效果測(cè)定

參照桑利偉等[12]的方法并進(jìn)行改進(jìn)，具體方法如下：采摘健康、新鮮、葉齡相同的胡椒嫩葉（直徑不大于9 cm），洗凈放于吸水紙上晾干；將假連翹提取物稀釋為50X和100X，對(duì)照藥劑烯酰·嗎啉WP配制為2 000X和4 000X，以不含有效成分的空白作對(duì)照，共5個(gè)處理。保護(hù)作用測(cè)定方法：先于真葉上施藥，晾干藥液后，用昆蟲(chóng)針在葉子正面等距離的位置刺傷，再用接種針將3塊直徑為6 mm的病原菌菌落邊緣菌餅接在相應(yīng)刺傷處，每皿1片真葉，正面朝上放于培養(yǎng)皿中，然后于人工氣候培養(yǎng)箱（25～28℃）中培養(yǎng)，5 d后測(cè)量各處理的病斑生長(zhǎng)直徑，按下式計(jì)算保護(hù)效果。

治療作用測(cè)定方法：先于嫩葉上接種菌餅，放于人工氣候培養(yǎng)箱（25～28℃）中培養(yǎng)2～3 d，測(cè)量各嫩葉上病斑生長(zhǎng)直徑d1后施藥，施藥后再置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種第5天測(cè)量各處理的病斑生長(zhǎng)直徑d2，按下式計(jì)算治療效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 假連翹提取物對(duì)胡椒瘟病菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)的抑菌活性

假連翹提取物對(duì)胡椒瘟病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制活性，結(jié)果見(jiàn)表1。

從表1可以看出，當(dāng)假連翹提取物供試濃度為10 mg/mL時(shí)，對(duì)胡椒瘟病菌菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)到100%，孢子萌發(fā)抑制率達(dá)到62.41%；當(dāng)供試濃度為5 mg/mL時(shí)，對(duì)胡椒瘟病菌菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)到86.87%，孢子萌發(fā)抑制率達(dá)到49.66%。可見(jiàn)，假連翹提取物對(duì)胡椒瘟病菌菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)均具有一定抑制作用。

2.2 假連翹提取物對(duì)胡椒瘟病菌的毒力

從表1中可以看出，假連翹提取物對(duì)胡椒瘟病菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性。進(jìn)一步測(cè)定不同濃度的假連翹提取物對(duì)胡椒瘟病菌菌絲生長(zhǎng)的毒力（EC50），結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2可以看出，假連翹提取物在相關(guān)系數(shù)為0.971 8時(shí)，對(duì)胡椒瘟病菌菌絲生長(zhǎng)的EC50為1.495 1 mg/mL。

2.3 假連翹提取物對(duì)胡椒瘟病的防治效果

假連翹提取物對(duì)胡椒瘟病的防治效果見(jiàn)表3。

從表3中可以看出，假連翹提取物對(duì)胡椒瘟病的防治效果明顯低于化學(xué)殺菌劑烯酰·嗎啉WP。當(dāng)假連翹提取物稀釋50倍時(shí)，保護(hù)效果達(dá)到77.55%，治療效果為37.06%，表現(xiàn)出較強(qiáng)的保護(hù)效果。在供試濃度下，對(duì)照化學(xué)殺菌劑烯酰·嗎啉WP的保護(hù)效果和治療效果均達(dá)到60%以上。

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，假連翹乙醇提取物對(duì)胡椒瘟病菌具有較好的抑菌活性。在供試質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，對(duì)胡椒瘟病菌菌絲生長(zhǎng)抑菌率高達(dá)100%，EC50為1.495 1 mg/mL；對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率為62.89%。組織法試驗(yàn)結(jié)果表明，假連翹提取物對(duì)胡椒瘟病的保護(hù)效果大于治療效果，但均低于對(duì)照藥劑烯酰·嗎啉WP。有研究報(bào)道，植物源農(nóng)藥對(duì)病蟲(chóng)害的防治效果普遍低于化學(xué)藥劑，但鑒于植物源農(nóng)藥對(duì)環(huán)境污染小，對(duì)作物靶標(biāo)安全，不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，隨著國(guó)家越來(lái)越提倡綠色防控，植物源農(nóng)藥將會(huì)有廣闊的發(fā)展前景。

據(jù)報(bào)道，Syuntaro Hiradate[13]等從假連翹中分離得到3種新的三萜皂甙類化合物，對(duì)芥菜幼苗生長(zhǎng)具有抑制活性。Heminder Singh[14]等研究發(fā)現(xiàn)，5%假連翹水提液在溫室條件下可以作為高粱霜霉病一種有前景的有機(jī)殺菌劑，并從中分離得到植物甾醇類化合物。以上研究報(bào)道與本研究中發(fā)現(xiàn)假連翹提取物對(duì)胡椒瘟病菌具有抑菌活性相一致，但具體的抑菌活性物質(zhì)有待進(jìn)一步分離。

參考文獻(xiàn)

[1] 桑利偉，譚樂(lè)和，劉愛(ài)勤，等. 海南省胡椒主要病害現(xiàn)狀初步調(diào)查[J]. 植物保護(hù)，2010，36（5）：133-138.

[2] 桑利偉，劉愛(ài)勤，譚樂(lè)和，等. 海南省胡椒瘟病病原鑒定及發(fā)生規(guī)律[J]. 植物保護(hù)，2011，37（6）：168-171.

[3] 桑利偉，劉愛(ài)勤，譚樂(lè)和，等. 胡椒瘟病田間發(fā)生規(guī)律觀察[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2010，31（11）：1 996-1 999.

[4] 崔昌華，鄭服叢，賀春萍，等. 海南胡椒主要真菌病害調(diào)查與病原鑒定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（6）：3 355-3 358.

[5] 戚仁德，丁建成，高智謀. 安徽省辣椒疫霉對(duì)甲霜靈的抗藥性監(jiān)測(cè)[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2008，35（3）：245-250.

[6] 趙衛(wèi)松，韓秀英，齊永志，等. 辣椒疫霉對(duì)雙炔酰菌胺的敏感性測(cè)定及其抗藥突變體生物學(xué)形狀研究[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13（1）：21-27.

[7] Demirci F， Dolar F S. Effect of Some Plant Materials on Phytophthora Blight（Phytophthora capsici Leon.） of Pepper[J]. Turk J Agric For， 2006， 30： 247-252.

[8] Ezziyyani M， Requena M E， Egea Gilabert C， et al. Biological control of Phytophthora root rot of pepper using Trichoderma harzianum and Streptomyces rochei in combination[J]. Journal of Phytopathology， 2007， 155（6）： 342-349.

[9] 賴建輝，賴榮泉，賴成連，等. 不同提取物對(duì)黃曲條跳甲種群的忌避作用及其保苗效果[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，27（4）：604-606，610.

[10] 徐武兵，鐘秋華，李林峰，等. 16種植物對(duì)福壽螺的趨避效果研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，37（11）：149-152.

[11] 黃艷飛，汪漢成，陳慶元，等. 六種殺菌劑對(duì)煙草赤星病菌菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)的抑制作用[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2016，18（2）：263-267.

[12] 桑利偉，劉愛(ài)勤，高圣風(fēng)，等. 防治胡椒瘟病生物農(nóng)藥篩選及其盆栽藥效試驗(yàn)[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2017，38 （5）：915-918.

[13] Hiradate S， Yada H， Ishii T， et al. Three plant growth inhibiting saponins from Duranta repens[J]. Phytochemistry， 1999， 52（7）： 1 223-1 228.

[14] Singh H， Zameer F， Khanum S A， et al. Durantol - a phytosterol antifungal contributor from Duranta repens， Linn. For organic Management of Sorghum Downy Mildew[J]. European Journal of Plant Pathology， 2016， 146（3）： 1-12.