分散固相萃取—超高效液相色譜—串聯質譜法檢測砂仁中15種有機磷類農藥

張振山 李萍萍 樂淵 劉春華

摘 要 建立了分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜檢測砂仁中15種有機磷類農藥殘留量的方法，并對16個不同產地的砂仁藥材進行農藥殘留測定。砂仁樣品經乙腈（含1%甲酸）提取和鹽析劑鹽析后加入N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）和無水硫酸鎂進行基質固相分散萃取、凈化，采用超高效液相-串聯質譜在多反應檢測模式（MRM）下測定，外標法定量。15種農藥成分在0.005～0.100 mg/L有良好的線性關系，相關系數在0.999～1.000；15種農藥成分在3個添加水平下（100、200和400 μg/kg），加標回收率范圍為70.0%～120.0%，RSD%（n=3）為0.5%～9.5%；各農藥成分的檢出限在0.1～2.0 μg/kg。該方法可應用于多產地的砂仁藥材中15種有機磷類農藥殘留的檢測。

關鍵詞 砂仁 ；有機磷類農藥 ；分散固相萃取技術 ；農藥殘留監測

中圖分類號 O657.63 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.09.016

Abstract A determination method for 15 phosphate pesticides in Amomum villosum Lour. was established by using ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS） with offline disperse solid phase extraction. The pesticide residues in the samples of A. villosum Lour collected from 16 areas were determined. The A. villosum samples were extracted with acetonitrile （containing 0.1% formic acid）， followed by salting-out， and the extracts were further purified by N-（n-propyl）ethylenediamine （PSA）， C18 and anhydrous magnesium sulfate. The prepared samples were analyzed by the UPLC-MS under Multi Reaction Monitor （MRM）， and the external standard method was applied to quantify the pesticides. These 15 pesticides showed a good linearity in the range of 0.005 mg/L～0.100 mg/L（r=0.999-1.000）. The average recoveries of all the pesticides were in the range of 70.0%～120.0% at the three spiked levels （100 μg/kg， 200 μg/kg and 400 μg/kg）， and the RSD （n=3） was in the range of 0.5%～9.5%. The limit of detection （LOD） was 0.1 μg/kg～2.0 μg/kg. This determination method was suitable for the analysis of 15 phosphate pesticides in A. villosum Lour.

Keywords Amomum villosum Lour. ； phosphate pesticide ； disperse solid phase extraction ； pesticide residues monitoring

砂仁是一味常用的中草藥和菜肴調味品，為四大南藥之一，具有化濕開胃，溫脾止瀉，理氣安胎的功效，用于治療濕濁中阻脘痞不饑，脾胃虛寒，嘔吐泄瀉，妊娠惡阻，胎動不安等癥[1]。隨著現代科學的發展，砂仁在治療消化系統方面問題的功效越來越受到人們的關注，砂仁的人工種植規模在逐步擴大[2]。

有機磷農藥是農業生產中應用最廣泛的農藥之一，具有廉價、高效、廣譜以及低生物累積性的特點[3]。但有機磷農藥對人體健康具有極大的危害，即使暴露于小劑量的有機磷化合物也會致命，中毒者常常由于橫膈膜和肋間肌麻痹以及氣道過多的分泌物引起呼吸衰竭而導致死亡，每年導致約20萬人死亡，因此要嚴格控制有機磷的殘留量[4]。目前，《中國藥典》2015年版對中藥材中有機磷農藥的檢測方法為氣相色譜法，本文選取了倍硫磷等15種有機磷農藥，建立了中藥砂仁的超高效液相-質譜法的多殘留檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

實驗所用16批砂仁樣品來自廣東、云南、海南、廣西的藥材基地和藥材市場（表1）。經粉碎機粉碎，過3號篩（藥典篩，50目），裝于密封袋中，置于干燥器中保存備用。

1.1.2 儀器

Triple Quad 4500液相色譜三重四極桿串聯質譜儀，美國SCIEX公司；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50.0 mm×2.1 mm；1.7 μm），美國Waters公司；IKAT 18高速均質器，德國IKA公司；高速冷凍離心機，美國VISION公司；渦旋混合儀，上海青浦滬西儀器廠。

1.1.3 試劑

標準物質：倍硫磷，丙溴磷，三唑磷，伏殺硫磷，甲胺磷，二嗪磷，馬拉硫磷，殺螟硫磷，滅線磷、治螟磷，地蟲硫磷，苯線磷，內吸磷，久效磷，保棉磷；農藥標準品均為體積分數1 000 μg/mL，購自天津農業部環境質量監督檢驗測試中心。液相色譜（HPLC）級乙腈、甲醇和二氯甲烷購自美國Fisher Sci-entific公司；醋酸銨、無水硫酸鎂、氯化鈉均為國產分析純，購自國藥集團化學試劑北京有限公司；超純水以美國Millipore公司Milli-Q超純水系統制備獲得；0.22 μm微孔濾膜購自安譜實驗科技（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制

1.2.1.1 農藥單標準儲備溶液

各取1 mL（1000 μg/mL）農藥標準溶液分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成質量濃度為100 mg/L的單標準儲備液，儲存于-18℃冰箱中備用。

1.2.1.2 混合標準工作溶液

各取0.10 mL上述單個農藥標準儲備液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成質量濃度為1.00 mg/L的混合標準工作溶液。再取1.00 mg/L的混合標準工作溶液1.00 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成質量濃度為0.10 mg/L的混合標準工作溶液。

1.2.1.3 系列濃度的標準工作液

分別移取混合標準工作溶液0.05，0.1、0.2、0.5、1.0 mL混合標準工作溶液于5.00 mL的容量瓶中，用甲醇水溶液（50%）溶解并定容至刻度，配制成質量濃度分別為0.01、0.02、0.04、0.10和0.20 μg/mL的系列濃度標準工作液。

1.2.1.4 基質標準工作溶液

精確稱取5.00 g空白砂仁樣品各5份，按1.2.2方法進行樣品處理后，分別移取1.00 mL的上清液和系列標準濃度工作液按照體積比1∶1混合均勻，配制成濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.05和0.10 μg/mL的基質標準工作溶液，按照1.2.3儀器工作條件，以待測物定量離子的峰面積對質量濃度作標準曲線，得到15種有機磷類農藥的線性方程及相關系數。

1.2.2 樣品的前處理

取16批藥材粉末，精密稱定5.00 g，置于100 mL離心管，加10 mL水浸泡15 min，加入4 g氯化鈉和2 g無水硫酸鈉，再精密加入20 mL乙腈（含1%甲酸），3 000 r/min渦旋震動60 s，再以5 000 r/min離心5 min。再取上層溶液5.0 mL于預先加200 mg PSA、200 mg C18及1 000 mg MgSO4的離心管中，渦旋60 s，再以5 000 r/min離心5 min 。取1 mL上清液與1.0 mL甲醇水溶液（50%）1∶1混合，過0.22 μm微孔濾膜，待UPLC-MS/MS分析。

1.2.3 儀器工作條件

1.2.3.1 UPLC工作條件

ACQUITY_UPLCTM BEH C18 1.7 μm 2.1×50 mm Column色譜柱，柱溫35 ℃，進樣量：5 μL，流動相A為1.0 mmol/L乙酸銨溶液（pH=4.5），流動相B為甲醇；梯度洗脫程序：0～2.0 min，90%～30%A；2 ～2.5 min，30% A；2.5～7.0 min，30%～5%A；7.0～9.0 min，5%A；9.0～9.1 min，5%A～90%A；9.1 ～10.0 min，90%A。流速為0.25 mL/min。

1.2.3.2 ESI-MS/MS 工作條件

正離子電離模式：毛細管電壓，5 500V；離子源溫度，550℃；霧化氣壓力，344.7 kPa；去溶劑氣壓力，413.7 kPa；氣簾氣壓力，172.4 kPa；碰撞氣壓力，55.2 kPa。多反應監測模式（MRM）下的質譜參數見表2。

2 結果與分析

2.1 譜圖分析

在電噴霧離子源電離模式下，分別對15種有機磷類農藥的單標溶液進行母離子全掃描，再對各自的子離子進行全掃描，每個化合物選擇2對響應值較高的特征離子作為定量離子和定性離子，并優化得到相應的去簇電壓、碰撞能量等參數，結果見表2。

取混合標準溶液經超高效液相-串聯質譜，獲得15種農藥成分的總離子流圖（圖1）和MRM色譜圖（圖2），各農藥對應的保留時間見表2。

2.2 方法學驗證和樣品測定

2.2.1 線性范圍的考察

取1.2.1中的系列濃度的標準工作液進行液質分析，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結果表明，在5.0～100.0 μg/L，標準曲線線性關系良好，相關系數R2均≥0.999，結果見表3。

2.2.2 定量限

取編號1的藥材（經檢測不含15種有機磷農藥），加入標準溶液進行樣品添加實驗，按照1.2.2提取方法進行前處理試驗并上機，以3倍信噪比（S/N）計算砂仁中15種農藥的檢測限，各農藥的方法檢測限在0.36 ～1.32 μg/kg 。根據10倍信噪比計算理論定量限在1.2 ～4.4 μg/kg。為配合實際樣品和定量準確， 本試驗從添加水平 0.2 μg/kg 一直添加到5.0 μg/kg ，通過添加回收率試驗的要求，發現添加濃度到 4.0 μg/kg 時，回收率均符合定量限的要求（表4）。因此，砂仁中15 種有機磷農藥的定量限通過實際添加回收試驗最終確定為 0.004 mg/kg。

2.2.3 加樣回收率實驗

結合定量限和倍硫磷等農藥的MRL值，選取0.004 0、0.006 4和0.050 mg/kg作為加樣回收試驗的3個添加濃度，取編號1的藥材，按照1.2.2提取方法，計算15種農藥回收率，每個水平平行測定3次 ，平均回收率和相對標準偏差RSD見表5。結果表明， 15 種農藥殘留的平均回收率范圍為 73.7%～118.1%；相對標準偏差范圍為 0.6%～9.6%，均滿足定量分析要求。

2.2.4 樣品測定

對市售的16批砂仁 ，按照上述的樣品前處理方法和儀器分析條件下進行檢測 ，每份樣品平行測定2次，并未在樣品中檢測出15種有機磷類農藥的存在。

3 結論與討論

3.1 前處理條件的選擇

中草藥成分復雜，干擾物多。砂仁是姜科植物果實，除富含乙酰龍腦酯、樟腦等揮發性成分外，也含有色素、脂肪酸、多糖、鞣質等成分[5]，在對樣品檢測前，需要對樣品進行一定的凈化處理，以防對于待測組分的干擾。目前，GPC、固相萃取（SPE）及各種吸附劑的基質固相分散技術被廣泛用于復雜基質樣品的凈化[6]。QuEChERS是近年來國內外在食品檢測中應用十分普遍的一項前處理技術，具有操作簡單、速度快、回收率高、可分析的農藥范圍廣等優點，但凈化能力較差[7]。因此，許多研究者在其基礎上尋找更多的吸附凈化劑不斷地改進方法，如加入十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）、石墨化碳黑（GCB）、氨丙基粉等[8-9]。本試驗采用含1%甲酸的乙腈提取砂仁樣品，再以PSA+C18作為吸附劑來凈化砂仁提取液，PSA可以有效地吸附砂仁藥材中的有機酸、鞣質等極性成分，C18則可去除砂仁中的一些非極性成分，15種農藥在5.0～100.0 μg/L范圍內線性良好，R2均≥0.999，在0.004 0、0.0064和0.050 mg/kg 3個添加水平進行回收試驗，15種農藥回收率在在70%～120%。

3.2 色譜條件的選擇

目前，檢測和分析食品中的有機磷農藥殘留的方法一般都采用氣相色譜法。中國藥典2015版收載方法也為采用氣相-氮磷檢測器或火焰光度計進行檢測，但檢測甲胺磷、水胺硫磷等對熱不穩定的農藥時，氣相色譜法的抗干擾能力較弱，樣品前處理方法也較復雜[10-11]。砂仁為芳香性較強的中藥，采用氣相色譜測定時，受到的干擾成分較多，常引起襯管和色譜柱的污染，影響儀器的靈敏度。本文采用超高效液相色譜-串聯質譜法檢測砂仁，方法簡便快捷，靈敏度高，基質效應小，準確度高，適用于砂仁中有機磷類農藥的檢測。

3.3 樣品測定

砂仁目前主要產于廣東、廣西、云南、海南四省，以云南、廣東產量最高，云南栽培面積最廣[12]。隨著人民健康意識的提高，砂仁的經濟價值在逐步提高，也刺激著藥農的種植熱情。砂仁目前常見的病蟲害有炭疽病、苗疫病、立枯病，葉斑病，鉆心蟲，白粉病、螻蛄、金龜子等，由于目前國內中藥的田間管理技術還比較薄弱，偶有民間噴施甲胺磷、五氯硝基苯等農藥的現象。本文采集的16批藥材中，經檢測，并未有倍硫磷等15種有機磷類農藥的檢出，推測原因為收集的樣品多來源于當地的藥材種植基地，收集的散戶藥材較少。但建立砂仁中有機磷農藥的液質檢測方法，對于砂仁中有機磷農藥的防控監測提供了一項重要技術手段，同時，也可以為姜科同屬的其他作物和藥材的檢測提供技術依據，具有一定的參考意義。

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