糖與溫度對短柄細葉連蕊茶花粉活力的影響

于波 朱玉 黃麗麗 孫映波 吳華玲

摘 要 為了建立短柄細葉連蕊茶（Camellia parvilimba Merr. et Metc. var. Brevipes Chang）花粉檢測和低溫保存的方法，克服該物種與其他山茶物種間因開花時間與空間不同所造成的雜交育種障礙，開展了糖與溫度對短柄細葉連蕊茶花粉活力的影響研究。采用離體萌發(fā)法，研究糖的種類（蔗糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖和山梨醇）、濃度（0.146～0.876 mol/L）、低溫（5～25℃）或高溫（30～35℃）處理以及-80℃低溫貯藏對花粉萌發(fā)的影響。結(jié)果表明：花粉在含有0.292 mol/L的蔗糖或乳糖的培養(yǎng)基中萌發(fā)率較高，分別可達16.17%和16.08%。低溫處理（5～25℃）對花粉萌發(fā)無不良影響，但高溫（≥30℃）能造成花粉萌發(fā)率顯著降低。經(jīng)30℃處理6 h后，花粉萌發(fā)率顯著下降至10.20%。花粉在-80℃條件下貯藏12個月后，萌發(fā)率仍可達11.12%。本研究為今后利用短柄細葉連蕊茶開展山茶物種間雜交育種，克服花期不遇等問題提供技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞 短柄細葉連蕊茶 ；花粉 ；生活力 ；貯藏力

中圖分類號 S685.14 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.09.005

Abstract In order to establish a method for pollen detection and cryopreservation of Camellia parvilimba and overcome the obstacle of cross breeding between Camellia parvilimba and other species due to the difference of flowering time and space， the effect of carbohydrate and temperature on the pollen vigor of C. parvilimba Merr. et Metc. var. Brevipes Chang was analyzed. The effects of carbohydrate （sucrose， lactose， glucose， maltose and sorbitol）， concentration （0.146 ～ 0.876 mol/L）， low temperature （5～25℃）， high temperature （30～35℃） and low temperature storage （-80℃） on pollen germination of C. parvilimba were studied through in vitro germination. The results showed that pollen germination rate was higher in the medium containing 0.292 mol/L sucrose or lactose， up to 16.17% and 16.08%， respectively. Low temperature （5～25℃） had no bad effect on the pollen germination， but the germination rate of pollen decreased significantly under high temperature （≥30℃）. After the pollen was treated for 6h at 30℃， the pollen germination rate dropped to 10.20%. After the pollen was stored for 12 months under -80℃， the germination rate was up to 11.12%.

Keywords Camellia parvilimba ； pollen ； vitality ； storage capacity

連蕊茶組（Sect. Theopsis Coh. St.）是山茶科山茶屬重要的一組植物，共49種，我國原產(chǎn)46種[1]。該組植物主要特點：花量大，花朵密集，多數(shù)種類具芳香氣息[2]；但也有不少缺點：花朵單瓣，花徑較小，色澤多為白色，比較單一，且葉片較小較薄，樹枝較細偏軟等。短柄細葉連蕊茶（Camellia parvilimba Merr. et Metc. var. Brevipes Chang）是連蕊茶組小喬木，產(chǎn)于我國廣東和江西[1]，樹體玲瓏，枝葉稠密，花小秀雅，花瓣背帶淡紅色可觀樹、觀花，可作花境、花壇、林叢類應(yīng)用，具有很高的觀賞和園林應(yīng)用價值[3]。

迄今為止，只有少數(shù)連蕊茶物種被引種馴化并用于茶花人工雜交育種，包括短柄細葉連蕊茶在內(nèi)的大多數(shù)連蕊茶還未系統(tǒng)地參與茶花的人工育種。因此，利用這些連蕊茶物種資源與茶花品種進行種間雜交，將二者具有的優(yōu)勢性狀互補，充分利用雜種優(yōu)勢改良傳統(tǒng)茶花，培育特色優(yōu)良的茶花新品種是今后茶花育種的重要工作。目前，已有川鄂連蕊茶（C. rosthorniana）和毛柄連蕊茶（C. fraterna）的花粉培養(yǎng)與低溫貯藏的研究報道[2，4]，但未見短柄細葉連蕊茶花粉生活力和低溫貯藏的研究報道。在許多研究報道中，糖和溫度是花粉離體萌發(fā)的主要影響因素[5-23]。本研究以短柄細葉連蕊茶花粉為試材，研究了糖的種類、低溫或高溫處理以及-80℃低溫貯藏對花粉萌發(fā)的影響，旨在為今后利用短柄細葉連蕊茶開展山茶屬物種間雜交育種，克服花期不遇等問題提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為短柄細葉連蕊茶，種植于浙江金華國際山茶物種園。采集即將開放，但尚未散粉的短柄細葉連蕊茶的花蕾，置于干燥處12 h，（25±1）℃。待花藥打開散粉時，收集花粉。先用鑷子將散粉的花藥輕輕取下，放在紙片上，干燥處放置24 h，（25±1）℃；然后將花粉連同花藥殼一起分裝到1.5 mL凍存管中，擰緊管蓋，放入-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 花粉生活力測定

花粉萌發(fā)適宜糖類測定：分別將含有0.292 mol/L的糖即蔗糖（100.0 g/L）、麥芽糖（105.2 g/L）、葡萄糖（52.6 g/L）、乳糖（100.0 g/L）和山梨醇（52.6 g/L）的5種固體培養(yǎng)基（8 g/L瓊脂，pH 5.5～6.0）加熱滴于載玻片上，冷凝后，用無菌牙簽將新鮮花粉均勻涂撒在培養(yǎng)基表面。將載玻片置于放有濕潤濾紙的培養(yǎng)盒內(nèi)，然后將培養(yǎng)盒裝入塑料自封袋密封，置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)（25±1）℃，培養(yǎng)24 h后，于顯微鏡下觀察拍照和統(tǒng)計，根據(jù)萌發(fā)率確定花粉萌發(fā)的適宜糖類。

花粉萌發(fā)適宜蔗糖濃度測定：設(shè)計5種蔗糖濃度，分別為0，0.146、0.292、0.584、0.876 mol/L，8 g/L瓊脂，pH 5.5～6.0。培養(yǎng)24 h后，于顯微鏡下觀察拍照并統(tǒng)計萌發(fā)率，以確定適合短柄山茶花粉萌發(fā)的適宜糖濃度。

低溫或高溫對花粉萌發(fā)影響的測定：模擬華南地區(qū)冬、春季夜間較低溫度（5～20℃）和中午較高溫度（25～35℃），將花粉培養(yǎng)分為2個階段，第一階段設(shè)置7種溫度，分別為5、10、15、20、25、30和35℃進行6 h培養(yǎng)處理，模擬夜間低溫或中午高溫。第二階段轉(zhuǎn)移至（25±1）℃條件下恢復(fù)培養(yǎng)18 h，顯微鏡下觀察統(tǒng)計萌發(fā)率，以測試冬春季夜晚低溫和中午高溫對短柄山茶花粉萌發(fā)的的影響。上述試驗培養(yǎng)基為0.292 mol/L蔗糖，8 g/L瓊脂，pH 5.5～6.0。

統(tǒng)計花粉萌發(fā)率時，每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)觀測100粒花粉以上。花粉管長度大于花粉粒直徑作為萌發(fā)標準。花粉萌發(fā)率（%）=萌發(fā)花粉數(shù)/花粉總數(shù)×100%，取平均值作為花粉萌發(fā)率。

1.2.2 花粉貯藏力測定

將-80℃超低溫冰箱保存0、3、6、9和12個月的花粉，取部分花粉按上述適宜條件進行萌發(fā)率測定。

1.2.3 顯微觀察

花粉萌發(fā)觀察采用ZEISS正置顯微鏡（Axio Scope A1，德國）。使用AxioVision軟件進行圖像捕捉和保存。

1.2.4 統(tǒng)計方法

使用 SAS V8.02軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan's （1955） 多重比較法進行差異顯著性測驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜糖類的篩選

濃度為0.292 mol/L（即100 g /L蔗糖當量）的不同糖類對短柄細葉連蕊茶花粉萌發(fā)率的影響，見圖1～2。結(jié)果表明，以蔗糖和乳糖為碳源時，花粉萌發(fā)率最高達16.17%和16.08%；無糖和葡萄糖培養(yǎng)基次之，分別為10.39%和9.52%；山梨醇再次之，麥芽糖最次，萌發(fā)率僅有3.03%。最高組、次之組和最次之組之間差異顯著，即蔗糖和乳糖均是最適宜花粉萌發(fā)的碳源供給者。

2.2 適宜糖濃度的篩選

培養(yǎng)基中蔗糖濃度對短柄細葉連蕊茶花粉萌發(fā)率的影響，見圖3。結(jié)果表明，隨著蔗糖濃度升高，花粉萌發(fā)率先升高后降低，其中當蔗糖濃度為0.292 mol/L時，花粉萌發(fā)率最高達16.17%；當蔗糖濃度升高到0.876 mol/L時，花粉萌發(fā)受到顯著抑制，萌發(fā)率僅為3.26%，顯著低于對照。顯微鏡觀察結(jié)果也證實，當蔗糖濃度為0.292 mol/L時，花粉萌發(fā)率最高（圖4）。因此，最適宜花粉萌發(fā)的蔗糖濃度為0.292 mol/L，即100 g/L。

2.3 低溫或高溫對花粉萌發(fā)的影響

本試驗?zāi)M華南地區(qū)冬春季溫度，對花粉培養(yǎng)分為2個階段，研究了第一階段的高溫或低溫對短柄細葉連蕊茶花粉萌發(fā)率的影響（圖5～6）。結(jié)果表明，將花粉置于5～25℃環(huán)境中培養(yǎng)6 h后，再恢復(fù)培養(yǎng)18 h，花粉萌發(fā)率較高，分別為16.47%、16.59%、15.79%、16.54%和16.17%，差異不顯著。隨著第一階段處理溫度的升高，花粉萌發(fā)率顯著降低，當處理溫度為30℃時，花粉萌發(fā)率降為10.20%；當處理溫度升高到35℃時，花粉萌發(fā)率進一步降低，僅為1.85%。因此，證實低溫對花粉的萌發(fā)沒有不良影響。

2.4 -80℃貯藏時間對花粉萌發(fā)的影響

花粉-80℃貯藏試驗，結(jié)果見圖7，花粉保存前萌發(fā)率為16.17%；貯藏3個月后，萌發(fā)率為15.57%，但與新鮮花粉萌發(fā)率差異不顯著；隨著貯藏時間延長，花粉萌發(fā)率有所下降，貯藏6個月后，花粉萌發(fā)率降為12.97%；貯藏9個月后，花粉萌發(fā)率為11.73%；貯藏12個月后，花粉萌發(fā)率仍然達11.12%，與貯藏6個月后的萌發(fā)率差異不顯著。

3 討論

花粉萌發(fā)時需要能量物質(zhì)，花粉自身會貯藏一些淀粉等糖類物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠促進花粉在適宜條件下啟動萌發(fā)。隨著花粉管的伸長，外源的糖類物質(zhì)將會影響花粉管的生長。花粉培養(yǎng)使用較為普遍的是蔗糖。本研究結(jié)果表明，蔗糖與乳糖能較好地促進短柄細葉連蕊茶花粉萌發(fā)，效果差異不顯著；葡萄糖濃度為0.292 mol/L時，促進花粉萌發(fā)效果次之；無糖或山梨醇再次之；麥芽糖最差。前人相似的研究結(jié)果表明，蔗糖比果糖和甘露醇更能促進櫻桃花粉的萌發(fā)[5]；在野生龍蒿萌發(fā)試驗中，蔗糖優(yōu)于麥芽糖和葡萄糖[6]。但也有不同結(jié)論，陳暄等對茶樹花粉萌發(fā)的研究表明，麥芽糖優(yōu)于蔗糖[7]；安國寧等對桃樹花粉萌發(fā)的研究則發(fā)現(xiàn)，葡萄糖優(yōu)于蔗糖[8]；許珂等對金銀忍冬花粉萌發(fā)的研究則表明，乳糖優(yōu)于葡萄糖、蔗糖和果糖[9]。因此，在進行某個物種花粉培養(yǎng)時，要先試驗才能確定適宜的炭源。值得一提的是，濃度為0.292 mol/L的無糖或葡萄糖促進花粉萌發(fā)的效果差異不顯著，表明作為炭源，此濃度的葡萄糖對短柄細葉連蕊茶花粉萌發(fā)促進效果不明顯；試驗中濃度為0.292 mol/L的麥芽糖培養(yǎng)基上的花粉萌發(fā)率還不及無糖培養(yǎng)基，表明麥芽糖不僅沒有促進作用，還嚴重抑制了花粉的萌發(fā)。

糖不僅提供花粉萌發(fā)和花粉管生長所需的能量，其適宜的濃度也能夠維持細胞內(nèi)外滲透壓平衡。前人研究結(jié)果表明，山茶屬多個物種如連蕊茶[3-4]、油茶[10]、紅山茶[11-14]、金花茶[15]、茶樹[7，16]的花粉體外萌發(fā)所需適宜蔗糖濃度在5%～20%（0.146～0.586 mol/L），其中川鄂連蕊茶為20%，毛柄連蕊茶為10%。本研究表明，短柄細葉連蕊茶花粉體外萌發(fā)所需適宜蔗糖濃度為10%。因此，進行連蕊茶組物種的花粉培養(yǎng)試驗時，也要先試驗適宜的糖濃度。

溫度對花粉萌發(fā)至關(guān)重要。許多植物花粉萌發(fā)的適宜溫度在20～28℃[15-17]；但一些植物花粉適宜萌發(fā)溫度較高，達30℃[18-19]；而有的植物花粉萌發(fā)適宜溫度較低，僅為10℃[20]，超過適宜溫度的范圍，花粉萌發(fā)就會受到不同程度的抑制。本試驗?zāi)M華南地區(qū)冬春季溫度，對花粉培養(yǎng)分為2個階段，第一階段設(shè)置了7種溫度，培養(yǎng)6 h后，再轉(zhuǎn)移至25℃恢復(fù)培養(yǎng)，主要目的是為了研究第一階段的高溫或低溫對長柄山茶花粉萌發(fā)率的影響。結(jié)果表明，第一階段5～25℃的培養(yǎng)，花粉萌發(fā)率較高，且差異不顯著，表明低溫對花粉萌發(fā)率沒有不良影響。而第一階段培養(yǎng)溫度達到30～35℃，花粉萌發(fā)率明顯降低。因此，在華南地區(qū)冬春季進行茶花雜交授粉時，不必擔心夜間低溫對花粉萌發(fā)的影響；但要充分考慮中午高溫對花粉萌發(fā)的影響。

花粉保存通常分為冷藏（4～5℃）、低溫（-80～-20℃）和超低溫（液氮-196℃）保存等幾種方式。一般來說，冷藏保存可短期內(nèi)保持花粉活力[3]；低溫保存可較長時間保持花粉活力[21-22]；超低溫保持可長期保持花粉活力[23]，但成本較高。本研究在-80℃保存1年后，短柄細葉連蕊茶的花粉萌發(fā)率仍然達到10%以上，可以解決花期不遇的問題，滿足雜交授粉對花粉活力的需求。

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