L02脂肪變模型中氧化應激的發生及羊棲菜多糖的干預作用

吳利敏+夏盛隆+申蘇建+夏宣平+薛戰雄+蔣益

[摘要] 目的 建立人正常肝細胞株（L02）脂肪變模型，探討軟脂酸（PA）對肝細胞氧化應激的作用及羊棲菜多糖（SFPS）對脂肪變肝細胞氧化還原系統的影響。 方法 采用0.5 mmol/L的PA誘導L02細胞建立脂肪變模型，并予以不同濃度（25、50、100 μg/mL）SFPS進行干預。Annexin V-FITC標記法檢測細胞的凋亡，MTT比色法檢測細胞增殖活力，測定細胞內過氧化產物丙二醛含量（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）。 結果 SFPS可抑制PA對L02細胞增殖活性的下降和凋亡率的上升，降低MDA含量，升高SOD水平，不同濃度組間比較差異有統計學意義且具有劑量依賴性。 結論 L02細胞脂肪變性時發生明顯的氧化應激，羊棲菜多糖能在一定程度上減輕氧化損傷、抗細胞凋亡。

[關鍵詞] 羊棲菜多糖；氧化應激；脂肪肝；軟脂酸

[中圖分類號] R575 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）34-0017-03

The occurrence of oxidative stress in L02 fatty model and the intervention of sargassum fusiforme polysaccharide

WU Limin XIA Shenglong SHEN Sujian XIA Xuanping XUE Zhanxiong JIANG Yi

Department of Gastroenterology， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To establish a model of fatty degeneration in human normal liver cell line（L02） and to investigate the effect of palmitate（PA） on oxidative stress in hepatocytes and the effect of SFPS on the redox system of fatty liver cells. Methods L02 cells were induced by 0.5 mmol/L PA to establish a model of fatty degeneration， and were treated with different concentrations of SFPS（25， 50， 100 μg/mL）. Cell apoptosis was detected by Annexin V-FITC labeling method. Cell proliferation activity was measured by MTT colorimetric assay. Intracellular peroxide products including malondialdehyde（MDA） and superoxide dismutase（SOD） were measured. Results SFPS could inhibit the decrease of proliferation activity and apoptosis rate of L02 cells， decrease the content of MDA and increase the level of SOD， and the difference was statistically significant among different concentration groups and dose-dependent. Conclusions The oxidative stress occurs in the fatty degeneration of L02 cells. Sargassum fusiforme polysaccharide can alleviate oxidative damage and resist apoptosis to a certain extent.

[Key words] Sargassum fusiforme polysaccharide； Oxidative stress； Fatty liver； Palmitic acid非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發病機制及病理基礎尚不完全明確，其中“二次打擊”[1]被認為是目前最為成熟的解釋發病機制的學說。氧化應激對于NAFLD的發生發展起著關鍵作用[2，3]。近幾年，有報道稱羊棲菜多糖（sargassum fusiforme polysaccharides，SFPS）經證實有抗凋亡[4]、抗氧化[5，6]、抗腫瘤[7，8]、抗肝纖維化[9，10]等多種生物活性。本研究主要觀察羊棲菜多糖在軟脂酸（palmitic acid，PA）所致肝細胞脂肪變模型中的干預作用，從而為中藥防治NAFLD提供理論及實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

正常人肝細胞株L02。

1.2 實驗材料

羊棲菜多糖（SFPS）由溫州醫科大學實驗室制備。Dispase購自日本Sanko公司，MTT粉購自美國Sigma公司，軟脂酸（PA）購自美國Sigma公司，DMEM高糖培養基購自美國Gibco公司，青霉素、鏈霉素購自上海碧云天生物技術研究所，優級胎牛血清購自杭州四季青公司，0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Abcam公司，四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自北京索來寶生物公司，MDA和SOD檢測試劑盒均為南京建成生物工程研究所產品。endprint

1.3 L02細胞脂肪變模型的建立和分組

在超凈工作臺、無菌條件下，采用貼壁法培養L02，將細胞分為五組，分別是對照組、PA模型組、SFPS-L組、SFPS-M組、SFPS-H組。對照組：加入細胞培養液。PA模型組：培養24 h后，給予0.5 mmol/L PA孵育48 h。SFPS-L組：25 μg/mL SFPS預處理24 h后，0.5 mmol/L PA孵育48 h。SFPS-M組：50 μg/mL SFPS預處理24 h后，0.5 mmol/L PA孵育48 h。SFPS-H組：100 μg/mL SFPS預處理24 h后，0.5 mmol/L PA孵育48 h。隨后測定相應的指標。

1.4 MTT法檢測細胞增殖活力

按上述分組，96孔板常規培養，每組6個復孔。終止培養前4 h每孔加入10 μL MTT，培養結束時棄上清液，每孔加入100 μL DMSO，微孔板震蕩儀振蕩10 min，應用酶標儀調至490 nm波長測各組OD值。以對照組A值為對照，計算PA模型組、SFPS-L組、SFPS-M組、SFPS-H組的細胞存活率。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

收集各組細胞，細胞用PBS洗滌2次。重懸細胞，用10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI避光常溫孵育5 min，流式細胞儀分析測得數據。

1.6 過氧化產物丙二醛含量（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）水平的測定

按以上分組處理后，收集培養板上的細胞和培養液，按照MDA和SOD檢測試劑盒的標準操作流程，分別檢測MDA含量、SOD水平。細胞分組培養6個復孔，取其均值。

1.7 統計學方法

采用SPSS16.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT法檢測L02細胞的增殖活力

以不同濃度的SFPS預處理及PA孵育L02細胞后，MTT法檢測各組細胞的增殖活力。肝細胞脂肪變性以0.5 mmol/L的PA作用L02細胞48 h為模型，細胞存活率為（64.7±2.5）%。在濃度25～100 μg/mL時，羊棲菜多糖可增強脂肪變肝細胞的增殖活性，差異有統計學意義（F=4.02，P<0.05）。SFPS-L組、SFPS-M組、SFPS-H組的細胞存活率分別升高至（70.0±3.0）%、（75.5±3.3）%、（84.1±3.7）%。

2.2 SFPS對細胞凋亡率的影響

對照組的細胞凋亡率為（5.1±2.0）%，而PA模型組L02細胞的凋亡率為（39.8±4.7）%。SFPS-L組、SFPS-M組、SFPS-H組的細胞凋亡率分別為（36.2±4.9）%、（27.8±2.9）%、（16.9±3.1）%，均顯著降低（F=3.95，P<0.05）。說明通過羊棲菜多糖的預處理可抑制脂肪變細胞凋亡，且有劑量依賴性（圖1）。

2.3 SFPS對PA所致L02細胞氧化損傷的影響

PA模型組上清液SOD活性明顯低于對照組，預先加入不同濃度SFPS可增加SOD活性，其中50、100 μg/mL濃度組與模型組比較有顯著性差異。PA模型組細胞MDA含量明顯高于對照組，預先加入不同濃度SFPS各組MDA的含量下降，25、50、100 μg/mL濃度組與PA模型組比較均有顯著性差異（P<0.05）。見表1。

表1 SFPS對PA所致L02氧化損傷的保護作用（x±s，n=6）

注：#P<0.05，##P<0.01 vs對照組；*P<0.05，**P<0.01 vs PA模型組。各處理組細胞的SOD活力（F=3.74，P<0.05）和MDA含量（F=3.38，P<0.05）總體均數不全相等

3討論

NAFLD的病理機制表明氧化應激在其發展早期可能已存在損傷。細胞通過呼吸利用氧產生ATP時，氧自由基或ROS的產生超過細胞的清除解毒能力，細胞的氧化與抗氧化失調產生大量的氧化中間產物造成組織、細胞損傷的狀態稱為氧化應激[11]。大量研究證據表明超量脂肪酸導致線粒體氧化超負荷，ROS和RNS生成過多而蓄積[12]，導致脂質過氧化產物和細胞因子的釋放，介導NAFLD的發生發展[13]。

不同性質的脂肪酸均可導致L02細胞發生以甘油三酯升高為特征的脂肪變性，對細胞有一定的毒性作用，但是飽和脂肪酸比不飽和脂肪酸更易造成細胞損害，它的脂毒性更強。通常無論是正常人還是NAFLD患者，體內的軟脂酸都是含量最多的一種飽和脂肪酸[14]。故本研究選用軟脂酸誘導L02構建肝細胞脂肪變模型。結果顯示PA模型組L02細胞增殖活性顯著降低，凋亡率增加，MDA含量升高，SOD水平降低，說明隨著細胞內脂肪酸的沉積，引起氧化應激和脂質過氧化，導致細胞抗氧化因子過量消耗和抗氧化酶活力衰竭。

降低氧化應激損傷、保護受損的肝細胞、減少肝細胞凋亡是治療NAFLD 的一個重要途徑。羊棲菜多糖是一種水溶性多糖，主要以褐藻酸、褐藻糖膠和褐藻淀粉的形式存在，為非細胞毒性物質，具有天然、安全、有效的特點，故其已引起人們的普遍關注。已有實驗證明，SFPS具有清除自由基、提高抗氧化酶活性及抑制脂質過氧化的作用[15，16]。陳慧玲等[17]發現SFPS可劑量依賴性地抑制H2O2所致血管內皮細胞存活率的降低，阻止LDH外漏，增加NO釋放，并減少MDA生成，提高SOD活性。倪小芬等[18]報道SFPS可對抗H2O2誘導的胰島β細胞的凋亡，增加抗氧化酶活性。王貞麗等[19]研究發現SFPS對氧化應激人成纖維細胞有保護作用。本實驗發現給予25 μg/mL SFPS處理后，脂肪變肝細胞的MDA含量降低，細胞增殖活性增加，細胞凋亡率降低。當給予的SFPS濃度增大到50 μg/mL、100 μg/mL時，細胞增殖活性增加及細胞凋亡率降低的效應更加明顯，MDA含量逐漸降低，SOD水平逐漸升高，說明SFPS能減輕PA引起的肝細胞氧化損傷，且保護作用在一定范圍內具有劑量效應關系。endprint

此外，羊棲菜多糖抗細胞凋亡的作用可能通過Bcl-2家族調節的線粒體通路進行。該家族中的Bax及Bcl-2能夠正負調控凋亡過程，在一定條件下形成同二聚體及異二聚體導致線粒體的外膜通透性改變，決定了細胞的生存與死亡。當Bax的量相對增高時，則Bax同二聚體增多，促進細胞凋亡。而Bcl-2的量相對增高時，Bcl-2同二聚體增多，形成Bcl-2-Bax異二聚體，兩者均能抑制細胞凋亡。文獻報道[20]，羊棲菜多糖能夠降低肝細胞株脂肪變模型中的Bax基因的表達，增加Bcl-2基因的表達，使兩者比值發生改變，從而發揮抗細胞凋亡作用。

綜上所述，本研究通過軟脂酸建立人正常肝細胞株脂肪變模型，觀察羊棲菜多糖對氧化應激損傷肝細胞的干預作用，結果發現羊棲菜多糖能在一定程度上減輕氧化應激、抗細胞凋亡，但其具體作用機制仍需進一步研究證實。

[參考文獻]

[1] 沈紅，柳濤，張莉，等.非酒精性脂肪肝細胞損傷敏感性的機制[J].世界華人消化雜志，2010，18（7）：685-688.

[2] Lewis JR，Mohanty SR.Nonalcoholic fatty liver disease：A review and update[J].Dig Dis Sci，2010，55（3）：560-578.

[3] Rolo AP，Teodoro JS，Palmeira CM.Role of oxidative stress：In the pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis[J].Free Radic Biol Med，2012，52（1）：59-69.

[4] 張杰，楊驕霞，詹必勛，等.羊棲菜多糖對高脂培養的胰島β細胞凋亡的影響[J].牡丹江醫學院學報，2015，36（2）：12-14.

[5] 王尊文，華玉琴，李國平，等.羊棲菜多糖對高血脂模型大鼠血脂和抗氧化功能的影響[J].中國海洋藥物，2008， 27（6）：13-15.

[6] 陳慧玲，況煒，章皓.羊棲菜多糖對高血糖所致血管內皮細胞的損傷的保護作用[J]. 現代實用醫學，2008，20（3）：168-170.

[7] Ji YB，Ji CF，Yue L. Human gastric cancer cell line SGC-7901 apoptosis induced by SFPS-B2 via a mitochondrial-mediated pathway[J]. Biomed Mater Eng，2014， 24（1）：1141-1147.

[8] Chen XM，Nie WJ，Yu Gq，et al.Antitumor and immunomodulatory activity of polysaccharides from Sargassum fusiforme[J]. Food Chem Toxicol，2012，50（3-4）：695-700.

[9] 薛海波，馬麗麗，林賢凡，等. 羊棲菜多糖抗肝纖維化的作用機制的實驗研究[J].現代實用醫學，2016，28（10）：1317-1319

[10] 張雪琴，吳金明，黃智銘，等.羊棲菜多糖對內毒素誘導的大鼠肝星狀細胞增殖活化、氧化損傷及凋亡的影響[J]. 世界華人消化雜志，2012，20（15）：1333-1337.

[11] 曾民德. 脂肪性肝病的氧應激及其治療對策[J].國外醫學·消化系疾病分冊，2005，25：263-266.

[12] Begriche K，Igoudjil A，Pessayre D，et al. Mitochondrial dysfunction in NASH：Causes， consequences and possible means to prevent it[J]. Mitochondrion，2006，6：1-28.

[13] Pessayre D.Role of mitochondria in non-alcoholic fatty liver disease[J]. J Gastroenterol Hepatol，2007，22（1）：S20-S27.

[14] Musso G，Gambino R，Cassader M.Recent insights into hepatic lipid metabolism in non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）[J]. Prog Lipid Res，2009，48（1）：1-26.

[15] Zhang QB，Li N，Zhou GF，et al. In vivo antioxidant activity of Polysaehcaride fraction from Poprhyra haitanesis（Rhode Phyta）in aging mice[J]. Pharmacological Research，2003，48（2）：151-155.

[16] 張燕平，張虹，洪泳平，等.羊棲菜提取物體外自由基清除能力的研究[J].鄭州工程學院院報，2003，24（l）：50-57.

[17] 陳慧玲，況煒，史鋒.羊棲菜多糖對血管內皮細胞氧化損傷的保護和修復作用的實驗研究[J].中國藥學雜志，2007，42（11）：829-831.

[18] 倪小芬，鄭超，田吉來，等.羊棲菜多糖對 H2O2誘導胰島β細胞凋亡的保護作用及PI3K抑制劑的影響[J].中華中醫藥學刊，2009，27（7）：1506-1508.

[19] 王貞麗，陳雪紅，韓彥弢，等.羊棲菜多糖對氧化應激人成纖維細胞的保護作用[J].中國海洋藥物，2015，34（2）：45-50.

[20] 吳利敏，吳金明，黃智銘，等.羊棲菜多糖對軟脂酸誘導的HL-7702細胞凋亡的保護作用[J].中華中醫藥學刊，2011，29（3）：634-637.

（收稿日期：2017-08-15）endprint