男性不育患者Y染色體AZF區微缺失的臨床研究

陳俊豐+殷瑋琪+王愷赟+馬超+王力+馬琪

[摘要] 目的 探討男性不育患者Y染色體微缺失檢測的臨床意義。 方法 應用PCR多重技術對293例無精子和嚴重少弱精子的不育患者（非梗阻性無精子癥159例、嚴重少弱精子癥134例）Y染色體上AZFa、AZFb和AZFc 3個區域進行微缺失檢測。 結果 在293例患者中，共檢出31例患者AZF區域微缺失，缺失率為10.58%；其中，非梗阻性無精癥23例，嚴重少弱精癥8例。上述患者中，4例位于AZFb區，5例位于AZFb+AZFc區，20例位于AZFc區，2例被檢出AZFc+AZFb+AZFa區域三重缺失。 結論 Y染色體AZF區微缺失是引起男性不育的重要原因之一，無精子癥和嚴重少弱精子癥不育患者有必要進行Y染色體微缺失檢查，便于早期診斷和治療。

[關鍵詞] Y染色體；AZF微缺失；男性不育；無精子癥；弱精子癥

[中圖分類號] R698.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）34-0007-03

Clinical study on microdeletion of AZF regions of Y chromosome in male infertile patients

CHEN Junfeng1，2 YIN Weiqi2 WANG Kaiyun1，2 MA Chao3 WANG Li3 MA Qi1，2

1.Translational Research Laboratory for Urology， Ningbo Key Laboratory， Ningbo First Hospital， Ningbo 315010， China； 2.Department of Urology， Ningbo First Hospital， Ningbo 315010， China； 3.Andrology Laboratory， Ningbo First Hospital， Ningbo 315010， China

[Abstract] Objective To investigate the clinical significance of Y chromosome microdeletion in male infertile patients. Methods PCR multiple technique was applied to perform microdeletion detection in the three regions of AZFa， AZFb and AZFc on the Y chromosome in a total of 293 infertile patients with azoospermia and oligoasthenospermatism（non-obstructive azoospermia in 159 cases and severe oligoasthenospermatism in 134 cases）. Results Among 293 patients， a total of 31 patients had microdeletion of AZF region， with the deletion rate of 10.58%； among them， non-obstructive azoospermia was in 23 cases， and severe oligospermia was in 8 cases. Of the above patients， 4 patients were located in the AZFb region， 5 were located in AZFb+AZFc region， and 20 were located in AZFc region. AZFc+AZFb+AZFa region triple deletion was detected in 2 cases. Conclusion The microdeletion of Y chromosome in AZF region is one of the important causes of male infertility. For the infertile patients with azoospermia and severe oligoasthenospermatism， there was a need to carry out Y chromosome microdeletion examination， which is easy to perform early diagnosis and treatment.

[Key words] Y chromosome； AZF microdeletion； Male infertility； Azoospermia； Asthenospermia

全球有10%～15%的育齡夫婦受困于不育，其中男性因素超過一半[1-2]。引起男性不育的因素很多，而無精子癥和嚴重少精子癥是男性不育中常見的病因[3]。造成非梗阻性無精子癥和嚴重少精子癥最常見遺傳學病因是精子發生基因的異常。Y染色體長臂11間隔存在控制精子發生的基因為無精子癥因子（azoospermic factor，AZF），AZF發生的區域主要有4 個：AZFa、AZFb、AZFc 及AZFd，這其中以AZFc 的缺失最多見，AZFb 的缺失次之，AZFa、AZFd 區少見[4-5]。這些區域任意1個位點的微缺失可導致精子發生障礙，臨床上可表現為男性無精子癥或嚴重少弱精子癥，因此對AZF的研究備受關注。本文利用兩組多重PCR技術對293例無精子癥和嚴重少弱精子癥患者外周血進行Y染色體AZF區微缺失檢測，探討在男性不育患者中Y染色體微缺失檢測的臨床意義。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料

篩選2012年11月～2015年4月在寧波市第一醫院泌尿外科就診的男性不育患者293例，年齡20～50歲，平均（27.64±4.57）歲，均有不育史，其中非梗阻性無精子癥159例，嚴重少弱精子癥134例。精液分析及無精子癥、嚴重少精子癥的診斷均按照WHO第5 版《人類精液檢查與處理實驗室手冊》要求進行[6]，即連續3次精液檢查并經離心沉淀檢測均無精子者為無精子癥，3次精子濃度均<5.0×106個/mL者為少弱精子癥。此外，本研究選取40例健康生育男性作為陽性對照，和10例女性作為陰性對照，以此監測樣本是否污染。

1.2 研究方法

Y染色體微缺失檢測：本研究參照歐洲男科學會和歐洲分子遺傳質量網聯合推薦的體系及位點，即在每個AZF區域使用2個序列標簽位點：SY84（AZFa）、SY86（AZFa）、SY127（AZFb）、SY134（AZFb）、SY254（AZFc）、SY255（AZFc）。利用這6個序列標簽位點通過兩套多重聚合酶鏈反應（PCR）擴增：Ⅰ組為SY254、SY86、SY127，Ⅱ組為SY255、SY84、SY134。

本研究直接用外周血作為底物擴增，改良強力多重PCR技術體系，PCR反應體系為20 μL，反應緩沖液包括60 mM Ttricine，5 mmol/L（NH4）2SO4，3.5 mmol/L Mgcl2，6%甘油，PH8.7，全血2.5 μL，dNTP 2 μL，1 μL突變型Tag酶，0.1～0.2 μM各引物濃度。PCR循環條件為：95℃初始預變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火90 s，72℃延伸60 s，35個反應循環后72℃延伸15 min，4℃保存樣品。Y染色體性別決定基因SRY為內控對照，已育健康男性的DNA作為陽性對照，正常女性DNA作為陰性對照，滅菌蒸餾水作為空白對照。PCR產物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳電壓120 V，電泳時間90 min，通過凝膠成像儀觀察分析。

2 結果

2.1 無精子癥和嚴重少弱精子癥患者中Y染色體缺失率情況

293名無精子癥和嚴重少弱精子癥患者中，31例發生AZF微缺失，總缺失率為10.58%。無精子癥159例中23例缺失，缺失率為14.47%；嚴重少弱精子癥134例中8例缺失，缺失率為5.97%；40例正常男性對照未發現缺失位點。

2.2 AZF不同區域的缺失率情況

31例AZF微缺失患者中，無精子癥23例，嚴重少弱精子癥8例。AZFb區域缺失4例，占1.37%；AZFc區域缺失20例，占6.82%；AZFb+AZFc區缺失5例，占1.71%；AZFa+AZFb+AZFc區缺失2例，占0.68%。在31例男性AZF缺失患者中無精子癥患者發生的缺失率明顯高于嚴重少弱精子癥患者。無精子癥和嚴重少弱精子癥患者各區域缺失具體情況見表1。封三圖1A為正常男性Y染色體微缺失檢測陰性結果電泳圖，封三圖1B為Y染色體AZFc區域微缺失檢測結果的電泳圖。

3 討論

引起男性不育有多種原因，其中無精子癥和嚴重少弱精子癥是影響男性不育的重要遺傳因素。Y染色體AZF區微缺失是導致精子發生障礙的重要原因之一，通過微缺失篩選可以避免一些不必要的藥物和手術治療。由于地區、民族、納入研究樣本的標準及選擇AZF區序列標簽位點的數量及位置差異，AZF微缺失發生率在無精子癥和嚴重少弱精子癥患者中也不盡一致。有研究表明AZF微缺失發生率在無精子癥和嚴重少弱精子癥患者中，分別為10%～15%和5%～10%[7]。韓瑞鈺等[8]報道1875例不育患者中，Y染色體微缺失率為11.6%，其中無精子癥缺失率為18.4%，少弱精子癥缺失率為4.8%，重度少精子癥缺失率為4.8%。Ambulkar等[9]報道在印度156名男性不育患者中，Y染色體缺失率達8.83%，其中在61名無精子癥患者中有8例Y染色體缺失，缺失率達13.1%，在嚴重少弱精子癥患者中Y染色體缺失率為5.3%。Naasse等[10]研究顯示，573名摩洛哥無精子癥和少精子癥患者中，有60例Y染色體微缺失，缺失率為10.5%，其中無精子癥和重度少精子癥患者中的缺失率分別為13.06%和1.55%。本研究顯示，Y染色體微缺失發生率在無精子癥患者中為14.47%，少弱精子癥患者中為5.97%，總缺失率為10.58%，與國內外報道相近。

Y染色體長臂AZF區，主要由四個相互獨立的區域AZFa、AZFb、AZFc和A ZFd組成，各個區域的缺失引起的臨床表型不同[11]。AZFa的缺失非常罕見，僅占男性不育Y染色體微缺失中的3%左右，整個區域缺失多表現為唯支持細胞綜合征，為原發性無精子癥[12-13]。AZFb缺失區域的患者，占男性不育Y染色體微缺失中的15%左右，生殖細胞成熟障礙，生精過程阻滯在初級精母細胞階段，睪丸內可見精原細胞和初級精母細胞，但無精子生成[13-14]。AZFa與AZFb區缺失的不育患者，即使睪丸穿刺也無法獲取精子，也不能做卵母細胞質內單精子注射，只能通過他人供精的方式生育后代。AZFc區域缺失最常見，占男性不育Y染色體微缺失中的60%左右，臨床表現多樣化，從輕度弱精子癥到無精子癥[13，15]。目前普遍認為，AZFc區域缺失的患者，尚存生成精子的能力，因此，可以通過輔助生殖技術生育自己的后代。AZFd缺失的患者，一般表現為中輕度少精癥，有些甚至是擁有正常的精子數，但精子的形態卻畸形。目前尚無文獻報道該區域獨立缺失的情況存在，其常同其他區域聯合缺失[16-17]。韓瑞鈺等[8]報道1875例不育患者中，217名患者Y染色體微缺失，Y染色體微缺失率為11.6%，AZFa區缺失8例，占3.7%；AZF b區缺失9例，占4.2%；AZFc區缺失122例，占56.2%，AZFb+AZFc區缺失46例，占21.2%，AZFa+AZFb+AZFc區缺失32例，占14.7%。Asadi等[18]研究報道1885名伊朗無精子癥和少精子癥患者中，有99例Y染色體微缺失，缺失率為5.2%。在這99例微缺失患者中，AZFc區域缺失患者為70例，缺失率高達70.7%，AZFb+AZFc缺失率為18.1%，AZFb缺失率為5.0%，AZFa與AZFa+AZFb+AZFc區缺失率均為3%。Kim等[19]報道，在1306例韓國男性不育患者中，有101例Y染色體微缺失，其中AZFc區域缺失率為53.5%，AZFb+AZFc缺失率為24.7%，AZFa+AZFb+AZFc缺失率為8.9%。一項對中國男性不育患者Y染色體微缺失的多中心研究顯示，在1808例不育患者中，發現有150例（8.3%）Y染色體微缺失，在這些微缺失患者中，有2例在AZFa區缺失，3例在AZFb區缺失，35例在AZFc區缺失，AZFb+AZFc與AZFa+AZFb+AZFc聯合缺失各有3例[20]。本研究尚未發現單純AZFa和AZFd區缺失患者，可能與這些缺失類型比較少見、收集樣本量較少有關。本文AZFb區域缺失4例，占12.9%，AZFc區域缺失20例，占64.52%，AZFb+AZFc區缺失5例，占16.13%，AZFa+AZFb+AZFc區缺失2例，占6.45%。我們報道的AZF各位點微缺失發生率與國內外報道有相同的趨勢。endprint

本研究表明非梗阻性無精子癥和嚴重少精子癥患者與Y染色體微缺失密切相關。Y染色體微缺失在輔助生殖中可垂直傳遞給后代，導致子代不育。因此為了減少這種遺傳病的發生，在輔助生殖前進行Y染色體微缺失檢測具有重要的臨床意義。

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（收稿日期：2017-09-25）endprint