稻田生態系統氧化亞氮（N2O）排放微生物調控機制?研究進展及展望

秦紅靈，陳安磊，盛榮，張文釗，邢肖毅，魏文學

（1.中國科學院亞熱帶農業生態研究所，亞熱帶農業生態過程重點實驗室，湖南 長沙 410125；2.中國科學院桃源農業生態試驗站，湖南 常德 415700）

N2O是全球第三大溫室氣體，其百年尺度單分子增溫潛勢（Global warming potential）約為CO2的298倍，對全球變暖的貢獻約為6%[1]。除此之外，N2O會與平流層中的臭氧發生反應，導致臭氧層的破壞。因此，未來的氣候變化和平流層中臭氧分配將在很大程度上取決于N2O排放和大氣中N2O的濃度變化[2]。

水稻田是重要的農業土地利用方式，全球水稻種植面積超過1.35億hm2[3]。我國是世界上水稻種植面積最大的國家之一，約2 900萬hm2，分別占世界水稻種植面積的28%和全國耕地總面積的27%左右[4]。水稻生長期間，農戶為提高產量往往采取淹水、落干、間歇灌溉等水分管理模式。頻繁的水分變化，導致土壤氧氣含量的頻繁變化，好氧條件更有利于硝化微生物的生長，從而通過硝化作用產生大量NON，厭氧條件有利于反硝化微生物的生長，加之硝化作用提供的大量NON存在，反硝化作用可以釋放大量的N2O，從而使稻田成為重要的N2O排放源。我國稻田N2O排放量占農田總排放量的11.4%[5]。因此，明確稻田生態系統N2O排放的微生物機制，對于減少稻田N2O排放與減緩全球變暖具有重要意義。

基于此，中國科學院亞熱帶農業生態研究所土壤微生物分子生態團隊依托中國科學院桃源農業生態試驗站，在過去10年（2009-2018年）重點圍繞農田生態系統碳、氮、磷循環過程的微生物作用機理及調控技術開展研究，為提高農田土壤氮素的利用率，控制農區環境富營養化，減少地下水NO污染和減少稻田系統溫室氣體N2O排放量等提供了重要的理論依據和技術保障。為慶祝建所40周年，本文對近10年的工作進行梳理，針對稻田生態系統產生及消耗N2O關鍵過程的微生物調控機制進行綜述，并在此基礎上提出了下一步研究重點。

1 N2O產生和消耗過程

土壤中的N2O主要是通過一系列土壤微生物過程產生，而后在土壤剖面內遷移擴散，部分被截留在土壤水或土壤孔隙中，部分被土壤反硝化微生物利用進一步轉化為分子氮（N2），剩余部分才能以N2O形式排出土壤。由此可見，土壤不僅具有產生N2O的能力，還具有吸收和消納N2O的能力。土壤-大氣界面監測到的N2O排放通量實質上是土壤中N2O產生、截留與消納綜合作用后的凈排放量。但由于土壤產生N2O的速率往往高于其消納速率，使得土壤成為N2O的排放源，因此，絕大多數研究僅關注了N2O凈排放，而忽略了N2O消納過程[6]。

1.1 土壤 N2O 產生過程

土壤N2O的產生主要是在一系列氮循環相關微生物的協同作用下進行的，包括硝化作用（Nitrification）、異養反硝化作用（Heterotrophic Denitrification）、自養反硝化作用（Autotrophic Denitrification）、硝酸鹽異化還原作用（Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonia）、硝酸鹽同化作用（Nitrate Assimilation）、 化 學 反 硝 化 作 用（Chemodenitrification）等[7]。但在自然和耕作土壤中，微生物硝化作用、反硝化作用被認為是土壤N2O的主要來源[8]，這兩個過程對于全球N2O排放的貢獻達到70%左右[9-10]。在土壤中硝化和反硝化過程基本是同時進行的，共同決定了土壤N2O的凈排放[11]。

硝化作用是指土壤中微生物將銨鹽氧化為硝酸鹽的過程[12]，包含氨氧化過程和亞硝酸鹽氧化兩個過程。氨氧化過程由氨單加氧酶（AMO）催化完成，是硝化作用的限速步驟，主要由氨氧化細菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）完成[13]，中間過渡產物為羥胺（NH2OH），NH2OH可以在羥胺氧化還原酶（HAO）作用下發生不完全氧化，產生N2O，也可以先產生硝酰基（NOH），而后進一步通過化學歧化作用產生N2O[14]。另外，氨氧化過程的產物亞硝酸鹽，也可以被自養氨氧化細菌進一步還原為NO、N2O，偶爾也可能被完全還原為N2，但N2O是最常見的終產物[15]。參與硝化作用的硝化菌是好氧菌，因此在通氣狀況良好時其活性較高，同時土壤pH、土壤氮素營養、有機碳和植物根系等環境因子也會影響土壤硝化作用[16]。反硝化作用是多種微生物參與的，硝酸鹽在硝酸鹽還原酶（Nar）、亞硝酸鹽還原酶（Nir）、一氧化氮還原酶（Nor）以及氧化亞氮還原酶 （Nos）的作用下，最終被還原成氮氣的過程。在這一過程中，N2O作為中間產物釋放[17]。硝化作用的終產物硝酸鹽是反硝化作用的反應底物，因此硝化-反硝化作用通常耦合發生，二者共同作用構成土壤氮肥損失的主要途徑，可達氮肥投入量的40%[18]。同一土壤上硝化和反硝化往往同時發生，各個過程的難控制性，以及檢測技術的精密性要求和方法的不成熟性，導致硝化與反硝化過程對氮素循環的相對貢獻依然不明確。

1.2 土壤N2O消耗過程

土壤中N2O的消耗過程可分為非生物參與的N2O截留過程和微生物參與的N2O轉化消納過程。非生物截留過程主要是指土壤產生的N2O在土壤剖面內擴散傳輸，被土壤水溶解、土壤孔隙固持等作用，受到土壤結構、土壤水氣狀態等物理特性的影響。Clough等[19]綜述了N2O氣體在土壤中的各種去向，指出N2O在下層土壤主要是以擴散、對流形式運動，通過土壤剖面內N2O氣體擴散系數可以準確估算最終N2O排放量，此外，被截留在土壤水氣中的N2O也能通過土壤空氣沸騰起泡或土壤徑流損失。微生物轉化過程主要是指含有氧化亞氮還原酶（NOS）基因的反硝化微生物將N2O還原為N2的過程。氧化亞氮還原酶（NOS）在反硝化過程中主導N2O的還原，因此以氧化亞氮還原酶基因（nosZ）為靶基因揭示微生物種群的N2O消耗還原能力是較直觀的[20]。影響NOS酶活性的環境因素也會影響土壤還原N2O的能力，有研究表明氧化亞氮還原酶活性降低會引起N2O/N2比率的升高，這一比率也會隨著NO3-增加而升高，因為NO3-比N2O更容易得到電子而阻礙N2O被還原[21]。而土壤水分狀況也會影響N2O還原酶的合成，進而影響反硝化產物中N2O/N2比率[22]。盡管土壤由于其固有的機械組成和孔隙結構可在一定程度上截留一部分土體N2O，延長N2O在土體中的滯留時間而不輕易的擴散至大氣中，但最終N2O的完全消耗只能通過微生物作用還原為N2。通常情況下異養細菌反硝化作用被認為是N2O消耗的主要原因[23]。N2O的非生物截留過程可以提高N2O在土壤中的留存時間，為N2O的生物消納提供了更大的可能性。研究表明反硝化作用作為N2O源或匯的強度不僅取決于生物因素（反硝化酶活性、微生物群落等），還與N2O在土壤中的擴散作用和水中溶解度密切相關[6,24]。因此，N2O在稻田土壤中的非生物截留過程和微生物轉化過程的協同研究對于土壤N2O總消納能力的認識很有必要。

2 驅動稻田N2O排放關鍵過程的微生物作用機理

2.1 水稻土淹水-落干過程N2O釋放的微生物驅動機制

水分是影響土壤N2O排放的關鍵因素之一[25]，稻田淹水和落干的轉變會導致土壤水分條件的時空變化，從而影響土壤硝化和反硝化作用活性[26-27]，所以干濕交替過程會造成土壤N2O的大量排放。利用室內培養試驗，探明了不同水分條件下反硝化基因的群落組成、數量與N2O釋放過程的關系并比較了細菌和真菌對N2O排放的貢獻。研究結果表明，水稻土含水量為80% WFPS時N2O釋放量最大，含水量在60% WFPS時細菌比真菌對N2O排放的貢獻要大。采用典型水稻土進行了淹水-落干和干濕交替過程的室內模擬試驗，結果發現，淹水-落干過程中Eh的變化與N2O釋放動態顯著相關，從而明確了稻田水分變化過程中，氧化還原電位的改變是調控N2O排放的主導因子。淹水-落干過程中N2O的釋放主要來自于細菌作用，真菌的貢獻只占10%左右[27]。反硝化微生物的組成和數量對落干過程反應敏感且迅速，排水后24小時硝酸還原酶基因（narG）和氧化亞氮還原酶基因（nosZ）豐度和群落組成便發生明顯變化，尤其是nosZ的響應更快，落干1 d即發生極顯著的變化，隨后不再發生顯著改變[28]，而narG基因隨落干的進行其組成和豐度由漸變到突變，但真菌amoA卻無明顯變化。統計結果顯示，narG基因豐度和組成與土壤Eh和N2O排放速率間呈顯著相關，而nosZ基因沒有這種相關性，表明水稻土淹水-落干過程中含narG基因的微生物種群組成和數量是驅動N2O排放的關鍵反硝化微生物種群，而含nosZ基因的微生物種群與N2O排放動態并無直接關系[29]。在此基礎上，進一步通過設計土壤培養試驗，系統研究了典型水稻土淹水-落干過程中不同土層N2O產生、轉化與釋放的關鍵微生物驅動機制。結果表明，在水稻土落干過程中0～3 cm土層是N2O排放的主要來源，落干過程中的硝化微生物與反硝化微生物的協同作用是導致表土層產生和釋放大量N2O的關鍵微生物驅動機制[30]。

2.2 水稻根際環境影響N2O釋放的硝化及反硝化分子機理

根際是土壤中根系周圍的狹小區域，距離根系表面1-3 mm，受植物根系與微生物活動的強烈影響[31]。根際環境中，植物、土壤和微生物之間通過物質和信息的交換形成復雜的交互作用關系，調控著農田生態系統土壤–作物系統中養分的轉化和循環[32]。水稻生長季節，水稻植株通過根系分泌物和根系凋落物等向根際輸入易于被土壤微生物利用的含碳有機物[33]。含碳有機物的分解不僅為反硝化微生物提供了有機底物，還可以提供電子，并且有機物質的分解作用需要消耗氧氣，可以促進厭氧環境的形成，有利于反硝化作用[34]。另外，水稻根系還可以向根際分泌O2，進而促進氨氧化過程產生NO3-[35]，新產生的NO3-擴散到附近的厭氧區域被反硝化還原為N2O或N2[36]。由于水稻根際O2狀況不同，硝化和反硝化作用在水稻根際的空間分布不同[37]。Arth 和 Frenzel[38]發現，硝化作用發生在水稻根表0-2 mm范圍內，反硝化作用發生在水稻根表1.5-5.0 mm范圍內。通過水稻根箱栽培試驗結合田間試驗研究了水稻根系生長影響N2O產生和釋放的微生物機理，結果表明，在淹水-落干過程中水稻根系生長顯著提高了根際區域N2O排放速率和土壤氨氧化細菌和含narG基因的硝酸還原菌的數量，并且二者之間具有顯著的相關關系，說明硝化微生物和反硝化微生物的協同作用是導致水稻土壤落干過程中根際土壤N2O釋放量增加的主要原因[39]。

2.3 施肥影響N2O釋放的微生物驅動機制

施肥是農業生產中最重要的農藝措施之一，施肥除了提高土壤肥力，還會對其他土壤性質產生影響，例如施用銨態氮肥會降低土壤pH。隨著中國農業集約化程度的不斷提高，化肥用量大幅增加，特別是氮肥的用量。長期不均衡的施肥容易造成土壤退化、環境惡化等負效應。化肥和有機肥的合理施用是維持提高地力，培肥土壤，提高作物產量的重要途徑。例如徐明崗等[40]研究發現，化肥和有機肥配施可以提高水稻產量，同時提高土壤有機質含量。然而，有研究發現，有機肥施用會通過改變土壤反硝化菌的群落結構，進而影響土壤N2O排放[41-42]。例如，Wolsing和Priemer 等[43]發現，有機肥相較于無有機肥處理，土壤中含nirK基因的反硝化細菌的群落結構存在顯著差異。Enwall等[44]發現施用有機肥明顯改變了含nosZ基因反硝化菌的群落結構，提高了土壤反硝化潛勢。基于此，依托中國科學院桃源農業生態試驗站水稻長期施肥定位試驗，分別在水稻分蘗期（淹水）和成熟期（落干）系統監測了不同施肥處理的N2O排放動態，土壤氮素轉化特征、反硝化潛勢、反硝化微生物種群結構和豐度等。結果顯示，與氮、磷、鉀肥均衡施用相比，長期不施磷肥顯著降低了亞硝酸還原酶基因（nirK）豐度和轉錄子豐度，抑制了部分含nirK基因種群反硝化菌的表達，而并未減少N2O還原酶基因（nosZ）豐度和表達豐度，從而降低了土壤反硝化潛勢和N2O排放，而長期不施鉀肥對N2O排放的影響較小。在氮、磷、鉀肥均衡施用的基礎上施加稻草，則會顯著提高nirK和nosZ基因豐度和表達豐度，從而提高土壤反硝化潛勢和N2O排放通量。相關性分析結果顯示，土壤N2O排放速率與nirK/nosZ基因表達豐度比值顯著相關（P ＜ 0.05），說明在評估有機肥施用對土壤N2O排放能力影響的時候，需同時考慮N2O的產生活性和轉化消納活性[45]。

2.4 水稻土N2O轉化能力、反應底物濃度及關鍵功能微生物組成結構間的耦合機制

水稻田淹水期的存在是水稻田區別于旱作農田的最大特征，而許多研究報道表明淹水或厭氧的環境有利于土壤N2O的吸收。水稻田是一種長期處于淹水缺氧狀態中的人工濕地系統，土壤環境極有利于其反硝化脫氮和N2O充分還原[4,17]。淹水狀態下的稻田土壤具有很強的N2O消耗潛力，在前述試驗過程中也發現淹水紅壤水稻土0～5 cm土層對N2O消耗轉化速率達到0.29～3.71 mg N/(h·kg)，但調控土壤N2O消耗能力的微生物機理并不清楚。此外，不同深度土壤生物、理化性質存在明顯的分異。上層土壤容重一般顯著低于下層土壤，分布著較多的土壤顆粒大孔隙，利于氣體擴散和對流，但淹水后土層持水量則會高于下層土壤[46]，同時，土壤養分、微生物也被證明主要分布于土壤表層[47-48]，因此土壤反硝化能力以及N2O消納能力在不同土層可能存在顯著差異[49-50]。以主要耕作表層（0～10 cm）水稻土壤為應試對象，通過嚴格厭氧密閉培養的方法分別對0～5 cm、5～10 cm原狀土壤進行外源N2O添加處理，探究不同土層深度水稻土壤N2O生物消耗能力和總消納容量的差異，結果發現，淹水厭氧培養條件下，底部外源添加不同濃度N2O，0～5 cm和5～10 cm水稻土柱均能消耗97.11%～99.55%的N2O添加量，表明兩土層均對外源添加N2O的消耗容量巨大。但兩土層的消耗能力仍存在較大差異，0～5 cm和5～10 cm土層N2O的最大消耗率分別可達到1.99、1.30 mg N2O-N/(kg·h)，可見 0～5 cm 土層土壤N2O消耗轉化能力顯著高于5～10 cm土層，這與土壤含nosZ基因功能微生物的數量分布顯著相關[51]。高濃度N2O添加會促進淹水土壤含nosZ基因的反硝化微生物數量增長，從而提高土壤N2O消耗能力。對稻田土壤N2O消耗能力及其機制的研究，可以為調控水稻田溫室氣體排放提供重要的科學參考。如何開發利用稻田土壤微生物資源，提高土壤N2O消耗能力，需要我們進一步探索。

2.5 水稻土N2O還原菌的篩選及功能差異機制研究

反硝化過程中，氧化亞氮還原酶催化的氧化亞氮還原反應是反硝化作用的最后一步，將N2O進一步轉化為N2，是目前已知的N2O唯一的生物消耗過程[52]。稻田土壤中淹水條件的存在為N2O還原提供了良好的條件，有利于反硝化作用的徹底進行，從而以N2的形式釋放氣體，甚至消耗大氣中的N2O，使稻田成為N2O的匯[53]。因此，稻田土壤N2O還原過程具有重要的研究意義。氧化亞氮還原酶由nosZ基因編碼，含有nosZ基因、具有氧化亞氮還原作用的反硝化細菌，可稱為氧化亞氮還原菌。目前的研究發現，nosZ基因具有nosZI和nosZII兩個分枝，二者具有生態位分化[54]。且由于含nosZII基因的反硝化微生物有很大比例（約51%）不具備nirK或nirS基因[55]，因此對于N2O的消耗具有更大的貢獻，目前很多研究認為含nosZII基因反硝化微生物在很大程度上決定了土壤作為N2O匯的能力[54-57]。但目前針對氧化亞氮還原菌展開的相關研究還較少，大部分研究主要集中在不同環境樣品中氧化亞氮還原菌的群落豐度和多樣性的比較[54,56,58]，缺乏對氧化亞氮還原菌作用機制的深入探究。因此，對氧化亞氮還原菌進行分離與鑒定，篩選出環境適應性強、N2O還原能力高的氧化亞氮還原菌，并對其N2O還原特性進行研究，對于該菌的實際應用，從而實現N2O減排具有重要意義。

利用微生物富集培養分離技術，從稻田土壤中分離得到了4株氧化亞氮還原菌，分別為Pseudomonas sp. DM15、Pseudomonas sp. DM22、Acinetobacter sp. DM24、Acinetobacter sp. DM27，根據不同試驗條件下4株菌N2O的還原量的比較發現，Pseudomonas sp. DM15具有更強的N2O還原能力。對該菌的有效利用可能為減少土壤N2O排放提供新途徑，實現微生物資源的有效利用[59]。

2.6 稻田N2O減排施肥技術研究

當前稻田的氮肥用量普遍偏高，減少氮肥投入是提高氮肥利用效率和降低稻田氮素損失的重要措施。但單純的長期減少氮肥用量，可能會導致土壤肥力和水稻產量的下降。因此，稻田氮肥施用量的調控應基于稻田特殊的水分管理和施肥特征。由于稻田氮磷等養分流失較其他土地利用方式嚴重，且化肥撒施是導致稻田氮磷流失的重要原因之一，我們構建了基于化肥一次性深施的減氮控磷施肥技術[60]，并建立了雙季稻減氮控磷長期定位試驗。連續6年的田間試驗結果表明，通過將雙季稻化肥施用方式由表面撒施變為深施，可以減少30%的氮肥用量，每年可減少雙季稻田氮肥投入量90 kg/hm2，同時將氮肥利用效率提高至44%左右，并且不會降低土壤有機質和全量養分含量，甚至提高土壤銨態氮、速效磷和速效鉀含量，保持土壤肥力水平，從而使雙季稻的產量增加5%～10%左右。除此之外，該施肥技術還可降低稻田表層水中70%～90%的銨態氮含量和20%～30%的總磷含量，每年減少雙季稻田氮流失量9 kg/hm2，磷流失量0.15 kg/hm2，并且改變稻田N2O排放模式，降低稻田N2O的排放量。當地農戶習慣在分蘗期施肥，導致N2O在該時期的大量排放，而氮肥減量深施處理除在雙季稻返青期和成熟期略有N2O排放外，其余生育期間幾乎無N2O排放。基于雙季稻田減氮控磷施肥技術的研發，學科組在桃源縣楓樹鄉開展了機械化大田示范。連續兩年的試驗結果顯示，與當地的常規化肥撒施相比，該技術可以顯著降低控制稻田表面水層的氮磷濃度，進而有效控制了氮磷損失，顯著提高了氮肥利用效率[61]。因此，通過進一步的技術改進和理論探究，該施肥技術可以在我國南方雙季稻田進行推廣應用。但是，目前氮肥深施減少N2O排放的機理尚不明確，還需要我們進一步探索。

3 分子生物技術在稻田土壤N2O釋放微生物調控機制研究中的應用

稻田土壤N2O產生、轉化和釋放的機制較復雜，參與的功能微生物種類繁多，新的分子生物技術手段的應用對于揭示其內在機理具有重要作用。近年來，穩定性同位素探針技術（Stable Isotope Probing，SIP）已成為研究土壤碳、氮循環，耦合微生物遺傳多樣性與功能多樣性最有力的工具之一[62]。第二代高通量測序技術的發展和成熟，使我們能夠對環境微生物進行深度測序，靈敏地探測環境微生物群落結構隨外界環境改變而發生的極其微弱的變化，對研究微生物與環境的關系、微生物資源利用有重要的理論和現實意義[63]。mRNA實時定量分析則可在基因表達水平預測功能基因的活性。在不同水平上分析轉錄組學、蛋白組學和代謝組學，有可能使硝化反硝化微生物的共生關系的機理研究取得突破性進展[64]。由于經典的16S rRNA方法已經不適合硝化、反硝化微生物的分子生態學研究，利用功能基因作為分子標記，研究根際土壤硝化、反硝化菌數量動態、群落結構、以及對氮素轉化的影響受到重視[65]。以功能基因為靶基因，利用上述分子生物學技術，結合傳統的土壤性質分析手段，有利于更深刻的揭示水稻土N2O產生和消納過程的微生物作用機理，以及環境對其產生的影響。

4 研究展望

由于紅壤的生態脆弱性及亞熱帶的氣候特征，亞熱帶紅壤區成為自然生態系統破壞與退化最嚴重的區域之一[66]，同時，亞熱帶紅壤區充足的水熱資源使其硝化反硝化過程較為活躍。綜上所述，針對稻田N2O排放關鍵過程的微生物作用機理已經取得了初步的進展，未來的土壤微生物與氮素循環研究應重點從以下幾方面開展：依托分子生物技術，從田塊尺度或室內控制試驗拓展到區域尺度，利用土壤微生物生物地理學理論和方法，深入解析亞熱帶紅壤區土壤微生物時空分布特征及微生物群落構建機制；利用穩定性同位素示蹤技術和新一代高通量測序技術，結合傳統純菌培養方法，在基因組和轉錄組水平構建農田土壤碳氮循環功能微生物分析平臺；研究亞熱帶區不同空間尺度下土壤微生物的分布規律、土壤微生物與植物群落是否存在協同分布與共進化，解析土壤微生物分布與生態功能之間的關聯機制；關注根系—土壤—微生物之間的協同機制以及植物—內生菌—土壤微生物之間相互影響的分子機制，解析土壤微生物在農田生態系統的功能及作用機制；關注土壤微生物對氣候變化的影響，以及在氣候變化背景下的響應過程，明確氣候變化與土壤微生物的交互關系；還需加強對實用技術的研發、推廣和示范工作，如硝化抑制劑、生物除臭劑、污水高效脫氮劑等，把基礎研究成果轉化為生產力，服務農業生產和生態文明建設。