水稻耐逆境種質創新研究十年回顧

肖國櫻，鄧力華，翁綠水，肖友倫，李錦江，于江輝，孟秋成

（中國科學院亞熱帶農業生態研究所亞熱帶農業生態過程重點實驗室，湖南 長沙410125）

水稻是我國60%以上人口的主食。南方稻區是我國水稻的主產區，水稻種植面積及產量分別占全國的85%以上。其充足的溫光資源不僅對水稻生長有利，也為水稻的病、蟲、草害發生提供了有利條件。其地理和氣候的多樣性，也常常形成高溫、低溫、干旱、淹澇等逆境脅迫危害水稻生產。近年來，氣候變化加劇，水稻耕作制度改變，水稻所遭受的逆境脅迫也日趨頻繁和嚴重。培育耐多種逆境脅迫的水稻新種質顯得更加迫切。

1 抗除草劑水稻新種質的創制

勞動力成本提高，倒逼水稻耕作制度改變，直播將是今后我國水稻栽培的主要方式[1]。草害是直播稻的主要減產因素。只要草害控制得當，直播稻與移栽稻產量相當、甚至更高。如果雜草控制不當，草害造成的產量損失少則10%，多則100%[2]。選擇性除草劑惡草酮、氰氟草酯、二氯喹啉酸、芐嘧磺隆、吡嘧磺隆等能有效的控制稻田主要雜草，但控制雜草的效果還受施用時間、土地平整度、優勢雜草種類、天氣等多種因素影響。更重要的是這些選擇性除草劑殺草譜較窄、殘效期長、殘留污染環境，影響后茬作物生長[3]。如咪草煙和咪唑乙煙酸是在美洲與一類稱為Clearfield?rice的抗除草劑水稻配套使用、用于控制雜草稻的必備除草劑，它們在土壤中的殘效期長達18周，不僅對后茬作物棉花、玉米、甜菜、油菜、花椰菜、生菜、土豆等造成傷害，而且還污染地表水，導致美國稻區地表水中殘留量達到 1 μg/L，巴西稻區更是高達7 μg/L[4]。相比較而言，草銨膦和草甘膦是低殘留的滅生性除草劑，在土壤中的半衰期為2-7 d，幾乎能殺死稻田中包括水稻在內的所有植物，且長期使用雜草也不容易產生抗藥性[3]。因此，培育抗草銨膦或/和草甘膦的轉基因水稻是解決直播稻草害最高效、最環保的途徑。

1.1 抗除草劑水稻新種質Bar68

不抗除草劑的不育系與抗除草劑的恢復系配組，產生的F1雜交種也抗除草劑。利用雜交種的抗除草劑特性，噴施除草劑清除雜交種中混雜的不育系，可以保證大田雜交種純度，消除雜交種中不育系混雜帶來的種子質量問題[5]。香兩優68是我國審定的第一個兩系雜交早稻品種，解決了過去三系雜交早稻熟期長、品質差的問題。但是，其不育系香125S的不育臨界溫度至少為24 ℃，制種過程中遇到低溫很容易自交結實。用抗除草劑基因Bar轉化其恢復系D68，獲得抗除草劑草銨膦的恢復系Bar68，不僅能利用其抗除草劑的特點消除雜交種中不育系混雜、保障大田雜交種的純度，而且適合直播、方便除草[6]。抗除草劑雜交早稻香125S/Bar68與香兩優68性狀相似，具有熟期適中、產量高、抗性較好、品質較優的特點。2002—2008年相繼進行了轉基因抗除草劑水稻Bar68的中間試驗、環境釋放和生產性試驗，并分別于2008年和2010年2次申報安全證書（表1～2），但均因政策原因沒有獲準[7]。抗除草劑水稻Bar68的培育成功，標志著我國在抗除草劑早秈稻恢復系新種質培育方面取得了突破性的進展。

表1 抗除草劑雜交早稻香125S/Bar68-1的生產性試驗結果Table 1 Productive trial of Xiang125S/Bar68-1, a glufosinate resistance hybrid for early cropping season

表2 轉基因抗除草劑水稻Bar68的安全評價歷程Table 2 Process of safety assessment for the glufosinate resistance rice Bar68

1.2 抗兩種除草劑的水稻新種質EB7001S

來源于土壤農桿菌CP4菌株的草甘膦抗性基因Epsps在密碼子使用偏愛性方面與水稻存在較大差別，直接在水稻中表達效率不高。按照水稻密碼子偏愛性優化該基因，其中消除了1處AT富含區序列、改變堿基163個、優化密碼子138個、G+C含量降為59.94%[8]。將抗草銨膦基因Bar和優化的抗草甘膦基因Epsps#轉化水稻不育系7001S，獲得了世界上第一例同時耐受草甘膦和草銨膦的抗除草劑水稻新種質EB7001S[9]。利用hiTAIL-PCR方法分析，發現目標基因插入水稻基因組第7號染色體的1470725位；以左右旁側序列為基礎，建立了轉基因水稻EB7001S的事件特異性檢測方法和基因型鑒定方法[10]。進一步的中間試驗（農基安辦字2013-T449）和環境釋放試驗（農基安審字〔2015〕第30號）表明，它耐受草甘膦的濃度至少為10 g/L、耐受草銨膦的濃度至少為4 g/L。同時抗草銨膦和草甘膦的轉基因水稻新種質培育成功，可以實現草銨膦和草甘膦在稻田的交替使用，避免長期使用單一除草劑帶來的雜草抗性風險，以及土壤中除草劑殘留的長期積累，具有重要的生產應用和環保價值。

1.3 新型抗草銨膦基因和轉基因抗除草劑水稻新種質創制

Bar基因是常用的抗草銨膦基因，它不僅被廣泛用作遺傳轉化的篩選標記，而且常用于抗除草劑作物的培育。Pat基因是另一種發現較早的抗草銨膦基因，它和Bar的同源性較高，也已廣泛應用于抗除草劑作物的研發[11]。但是，來源于細菌的原始Pat基因不僅密碼子偏愛性與水稻不同，而且起始密碼子也與水稻的不同，在水稻中直接表達沒有生產應用價值。人工優化的Pat#基因密碼子使用偏愛性與水稻相同，起始密碼子由GTG改為ATG，G+C含量從69.75%降為61.41%，消除了多處mRNA發夾環結構，起始自由能的絕對值降低，其轉基因水稻植株對草銨膦的耐受濃度達到2 g/L[12]。

Mat基因是一類新的抗草銨膦基因，它與Bar和Pat基因的序列同源性不高。來源于細菌的原始Mat基因在水稻中直接表達也沒有生產應用價值。人工優化的Mat#基因密碼子使用偏愛性與水稻相同，G+C含量降為60.11%，mRNA二級結構得到優化，其轉基因水稻植株對草銨膦的耐受濃度至少為1 g/L[11,13]。這些新型抗除草劑基因的利用和抗除草劑水稻的創制，擴展了抗除草劑基因的來源、豐富了抗草銨膦水稻的種質庫。

1.4 抗除草劑、品質改良水稻新種質的創制

國際上，把轉化得到單一外源性狀的稱為第一代轉基因作物，把具有多種外源性狀的稱為第二代轉基因作物，把具有多種外源性狀、且包含對消費者有利的外源性狀的稱為第三代轉基因作物。抗除草劑轉基因水稻的種質創新也將遵循這個發展規律。

植酸酶能水解植酸磷復合物，并釋放肌醇、無機磷及被植酸螯合的一些微量元素，具有提高人和單胃動物對食物中磷及金屬離子的利用率、減少磷從糞便中排放污染環境的作用。抗菌肽是生物體產生的具有抗菌活性的小分子肽類的總稱。牛乳鐵蛋白肽是迄今發現的抗菌抑菌活性最高的抗菌肽之一，對維持腸道健康、提高免疫力具有重要作用。以Bar基因作為篩選標記基因，將植酸酶-牛乳鐵蛋白肽融合基因PhyLf導入水稻并在其胚乳中特異表達，獲得了植株抗除草劑、種子具有植酸酶和抗菌肽活性的轉基因水稻新種質BPL9K。體外檢測結果表明，其種子中植酸酶活性最高達到32.30 U/g，種子提取蛋白液經腸激酶消化后具有抑菌活性[14,15]。植酸酶-牛乳鐵蛋白肽融合基因是一個人工合成的新基因，也是迄今為止第一次有人將這2個基因融合并在水稻中表達。如能在單胃動物體內驗證該轉基因稻谷具有植酸酶和抗菌肽的功效，它將一舉解決飼料中需要添加植酸酶和抗菌素的兩個問題，起到提高飼料中磷的利用率、減少糞便中磷的排放、消除抗生素濫用的作用，具有重要的生產應用價值。

2 抗螟蟲、抗除草劑水稻新種質的創制

螟蟲是危害水稻的主要害蟲。水稻中至今沒有發現高抗螟蟲的種質資源。當前，控制水稻螟蟲危害只能依靠高毒殺蟲劑阿維菌素和水胺硫磷、中等毒性殺蟲劑毒死蜱等化學農藥。蘇云金桿菌產生的Bt蛋白質對二化螟、三化螟、大螟、稻縱卷葉螟等水稻鱗翅目害蟲具有毒殺作用，利用基因工程技術向水稻中導入Bt抗蟲基因，是創制抗螟蟲水稻新種質的唯一有效途徑。

2.1 抗蟲基因Cry2Aa的優化和抗蟲、抗除草劑水稻新種質創制

來源于蘇云金桿菌的原始Bt基因在水稻中表達不強，需要對原始Bt基因進行改造才能在水稻中高效表達。Cry2Aa蛋白與常用的Cry1A蛋白序列同源性不高，可避免靶標害蟲的交互抗性。人工優化的Cry2Aa#基因的GC含量從34.81%提高到57.3%，消除了4處潛在的內含子切割識別序列和在真核生物中影響mRNA穩定的序列，mRNA的總自由能絕對值降低了23.9 kcal/mol，密碼子使用的偏愛性與水稻相同[16-17]。

B2A4008S是以Bar基因為篩選標記基因、轉化人工優化的Cry2Aa#基因獲得的抗除草劑、抗蟲水稻不育系新種質。它高抗稻縱卷葉螟、耐草銨膦，保持了光溫敏核不育水稻的育性轉換特性[18]，是世界上第一例抗除草劑、抗螟蟲水稻不育系。

B2A68是以Bar基因為篩選標記基因、轉化人工優化的Cry2Aa#基因獲得的抗除草劑、抗蟲早秈稻新種質。抗蟲試驗結果表明，轉基因水稻B2A68及其雜交組合對稻縱卷葉螟、大螟等鱗翅目害蟲表現高抗[19-20]。利用hiTAIL-PCR方法分析，發現目標基因插入水稻基因組第3號染色體非編碼區；以左右旁側序列為基礎，建立了轉基因水稻B2A68的事件特異性檢測方法和基因型鑒定方法[21-22]。采用ELISA檢測法，揭示了B2A68純雜合基因型、不同組織及不同發育時期葉片中Cry2Aa蛋白的時空表達特征[23]。

2.2 抗蟲基因Cry1Ca的優化和抗蟲、抗除草劑水稻新種質創制

Cry1Ca蛋白是與Cry1A、Cry2A蛋白序列同源性不高的另一類Bt殺蟲蛋白。人工優化的Cry1Ca#基因的GC含量從36.51%提高到55.47%，消除了23處AT富含區序列和18處內含子剪切信號位點，不存在潛在的Poly(A)加尾信號位點和常用的酶切位點，密碼子使用的偏愛性與水稻相同[24]。

B1C893是以Bar基因為篩選標記基因、轉化人工優化的Cry1Ca#基因獲得的抗除草劑、抗蟲水稻新種質。ELISA檢測發現，B1C893根系中Cry1Ca蛋白的表達量最低，葉片中最高，達到35.073 μg/g葉片鮮重。抗除草劑和抗蟲生物測定結果顯示，B1C893對除草劑草銨膦和稻縱卷葉螟均具有很好的抗性[25]。利用hiTAIL-PCR方法分析，發現外源基因的插入位點位于水稻第8號染色體上第25981位。根據插入序列的特點，我們建立了轉基因水稻B1C893事件特異性檢測方法和基因型鑒定方法[26]。

以攜帶抗褐飛虱基因Bph14、Bph15和抗白葉枯病基因Xa23的水稻恢復系R106為受體，采用農桿菌介導法轉化抗除草劑基因Bar和抗螟蟲基因Cry1Ca#，創制出了抗褐飛虱、抗白葉枯、抗螟蟲、抗除草劑草銨膦的四抗水稻新種質B1C106[27]。這是迄今為止水稻內源抗性和外源抗性聚合最多的多抗水稻新種質。

3 耐旱、耐低溫、耐鹽和抗除草劑水稻新種質的創制

中國本來就人多地少，經濟建設對優質耕地的蠶食使得維持水稻種植面積極為艱難。因此，利用不良土壤和不良氣候地區土壤種植水稻，是保證水稻播種面積、維持稻谷產量、保障口糧安全的重要途徑。創制耐旱、耐鹽、耐低溫水稻新種質，是利用這些不良耕地種植水稻的基礎工作。

干旱響應轉錄因子DREB （dehydration responsive element binding protein）能特異地與干旱反應原件結合，誘導許多下游逆境基因的表達，產生對干旱、低溫及高鹽等逆境的響應。我們分別克隆了擬南芥和薺菜的AtDREB1A和CbDREB1A基因[28]。以Bar基因作為篩選標記，轉化AtDREB1A基因[29]和CbDREB1A基因[30]的粳型光溫敏核不育系4008S均表現出耐旱性增強、且抗除草劑草銨膦。

OsbHLH1基 因 編 碼bHLH（basic helix-loophelix）類轉錄因子，與水稻耐寒性相關。利用Bar作為篩選標記基因，將OsbHLH1基因轉化粳稻品種東稻3號，獲得的轉基因水稻抗除草劑草銨膦、低溫條件下光合速率的下降率顯著低于非轉基因對照，說明增強了轉基因水稻耐低溫的能力[31]。利用Bar作為篩選標記基因，將OsbHLH1基因轉化粳稻恢復系淮C17，獲得的轉基因水稻芽期、苗期的耐低溫能力增強，且抗除草劑草銨膦[32]。

甜菜堿在植物中的積累可以提高植物耐旱、耐鹽能力。植物體內甜菜堿的合成途徑為膽堿→甜菜堿醛→甜菜堿。其中第一步由CMO（choline monooxygenase）催化完成，第二步由BADH（betaine aldehyde dehydrogenase）催化完成。利用Bar作為篩選標記基因，將山菠菜膽堿單加氧酶基因（AhCMO）轉化粳稻品種東稻3號，獲得的轉基因水稻抗除草劑草銨膦、耐鹽能力強于非轉基因對照[33]。利用Bar作為篩選標記基因，將山菠菜甜菜堿醛脫氫酶基因（AhBADH）轉化秈稻不育系P88S，獲得的轉基因水稻抗除草劑草銨膦、耐鹽能力明顯高于非轉基因對照[34]。

大豆紫色酸性磷酸酶基因GmPAP3主要參與鹽脅迫、滲透脅迫和氧化脅迫的響應，能提高抗氧化能力、減輕由NaCl和PEG處理引起的氧化損傷。利用Bar作為篩選標記基因，將GmPAP3基因轉化粳稻品種吉粳88，獲得的轉基因水稻在鹽脅迫條件下的種子萌發率、芽長和根長、幼苗成活率均比非轉基因對照高，且抗除草劑草銨膦[35]。

4 抗褐飛虱、抗白葉枯病水稻新種質的創制

水稻白葉枯病與褐飛虱是國內外稻作區經常發生的2種重要病蟲害。長期生產實踐證明，選育與利用抗性品種是防治白葉枯病、褐飛虱最有效、經濟、安全的途徑。但是，目前廣泛使用的雜交稻親本Y58S、廣占63S、榮豐A、華占、岳恢9113等均不抗這2種重要病蟲害，所配的雜交稻整體抗性水平低，急需進行改良。

4.1 優良恢復系華占、岳恢9113的白葉枯病和褐飛虱抗性改良

華占和岳恢9113是目前我國水稻生產上應用較多的雜交稻恢復系，可與兩系及野敗型三系不育系配組，所配的組合產量高、米質優、適應性廣。目前，以它們為父本配制的組合C兩優343、天優華占、岳優9113在南方稻區的推廣面積大，已分別成為湖南省一季晚稻、雙季遲熟晚稻和雙季中熟晚稻的區試對照品種。但是它們的褐飛虱和白葉枯病抗性差，既存在病蟲暴發風險，也嚴重限制了它們的推廣應用范圍。

將抗白葉枯病基因Xa23和抗褐飛虱基因Bph14、Bph15同時聚合到強優恢復系華占背景中，獲得了3個基因均純合的15個改良恢復系品系，其白葉枯病抗性水平從至少中感提高到了高抗，褐飛虱抗性水平從6.3級提高到≤3.0級。天豐A與15個改良恢復系配制的15個組合與對照組合天優華占相比，其白葉枯病抗性水平從至少中感提高到了高抗，褐飛虱抗性水平從5.0級提高到≤3.0級，其中組合天豐A/R43-06和天豐A/R43-07的2年小區平均產量高于對照天優華占，具有較好的生產應用前景[36]。

以岳恢9113為輪回親本，分別獲得了含純合抗白葉枯病基因Xa21和抗褐飛虱基因Bph14、Bph15的改良恢復系品系7個。所有改良恢復系及其與C815S所配組合，除對FuJ菌株（R8小種）表現感病外，對其余接種菌株均表現中抗以上抗性水平，對白葉枯病的抗譜及抗性水平較未改良的岳恢9113及對照組合C兩優343均顯著改良。苗期抗褐飛虱鑒定結果表明，所有改良恢復系及其與C815S所配組合均表現抗或高抗褐飛虱，褐飛虱抗性明顯強于未改良的岳恢9113及對照組合C兩優343。農藝性狀與小區產量測定結果表明，改良恢復系所配組合C815S/BX9113-01和C815S/BX9113-12產量較高、抗性較好，具有較好的生產應用價值[37]。

4.2 優良不育系Y58S、廣占63S和榮豐B的白葉枯病和褐飛虱抗性改良

Y58S、廣占63S、榮豐A是當前雜交稻育種中廣泛應用的兩系與三系不育系。迄今為止，Y58S為母本配制的組合有78個通過了國家或省級品種審定，廣占63S為母本配制的組合有16個通過了國家或省級品種審定，榮豐A為母本配制的組合有22個通過了國家或省級品種審定（http://www.ricedata.cn/variety/）。但是，這些組合均表現為感白葉枯病與褐飛虱，既存在病蟲暴發的風險，也限制了它們的推廣應用范圍。

以Y58S、廣占63S為輪回親本，采用分子標記輔助選擇與表型鑒定技術相結合，分別獲得了含純合抗白葉枯病基因Xa21和抗褐飛虱基因Bph14、Bph15的改良不育系科BX58S-2和科BX63S-2。孕穗期剪葉接種5個致病力強的白葉枯病菌株，結果顯示，科BX58S-2和科BX63S-2除對FuJ菌株表現感病外，對其余4個菌株均表現中抗以上抗性水平，而未改良的Y58S和廣占63S對全部菌株均表現感病。苗期褐飛虱抗性鑒定結果表明，科BX58S-2和科BX63S-2抗褐飛虱級別均為3.67級，抗性水平明顯高于Y58S（7.67級）與廣占63S（9.00級）。此外，改良不育系科BX58S-2和科BX63S-2的不育臨界溫度低、異交特性好、配合力高，顯示出了很好的應用前景[38]。

以保持系榮豐B為輪回親本，利用分子標記輔助回交技術獲得了含抗褐飛虱基因Bph14和Bph15且株葉形態較好的改良株系9個。苗期褐飛虱抗性鑒定結果表明，改良保持系的褐飛虱抗性級別從9.00級（榮豐B）提升到了至少2.33級。連續成對回交產生的不育系鑒定結果表明，由改良保持系科Bph18B-2（B6-11）獲得的不育系科Bph18A-2花粉敗育徹底、株葉形態好，具有較好的應用價值[38]。

5 耐高溫、耐干旱新種質挖掘與耐澇新種質創新

水稻雖屬喜溫作物，但抽穗期35 ℃以上高溫和干旱對花粉育性和結實率影響很大，嚴重影響水稻產量。爪哇稻的耐旱、耐熱性較強。以20%PEG-6000作為滲透介質模擬干旱條件，芽期處理秈爪交重組自交系群體RIL47的270個株系，從中篩選出了最耐旱株系47-274和最敏感株系47-299[39]。利用秈爪交重組自交系群體RIL47的254個株系為材料，在抽穗揚花期進行高溫處理，篩選出5個耐高溫株系（07H1619、07H1590、07H1521、07H1706、07H1608）和3個高溫敏感株系（07H1751、07H1710、07H1719）[40]。通過人工氣候室鑒定和分期播種試驗，對來自不同國家和地區的95份爪哇稻資源進行抽穗開花期耐高溫特性評價，篩選出了3份抽穗期耐高溫爪哇稻新種質（IRAT109、260和L4-34）[41]。

抽穗開花期高溫對34份東北粳稻花粉育性和結實率的影響研究結果表明，東稻2號、東農03-33、東農415-1、合江195和吉粳3的高溫適應性較強[42]。對這5個抽穗期高溫適應性較強的東北粳稻進行分期播種試驗，從田間農藝性狀表現和各材料結實率與自然溫度之間的關系來看，東稻2號和合江195可以較好的抵御初夏高溫、作為早稻在湖南種植[43]。

水稻是半水生植物，長期深水澇漬會嚴重影響其生長，較長時間沒頂淹澇會導致植株死亡。FR13A是世界上最耐淹的水稻品種，但是它稈高、感光、農藝性狀差，沒有直接利用價值。利用根據耐澇基因Sub1的序列開發出了1個共分離的分子標記Sub1-1，同時在耐淹澇鑒定時采用2次淹澇法進行淹澇脅迫處理，創制出了1個耐淹澇、苯達松敏感的光溫敏核不育系Sub-1BS，它可作為耐澇育種的中間材料使用[44]。

6 展望

矮稈水稻種質資源的發現和利用，實現了水稻產量的第一次飛躍。野敗細胞質雄性不育株的發現，奠定了水稻雜種優勢利用的基礎，成就了水稻產量的第二次飛躍。可見，優異種質的挖掘和創新是一項至關重要的基礎性工作。分子生物學、功能基因組學和育種學的發展，使得水稻產量水平大大提高，水稻超高產品種的產量潛力已經達到畝產1 000 kg（15 t/hm2）以上。今后，依靠單個基因來顯著提高水稻產量的道路將越來越艱難。提高水稻產量潛力需要高產、多抗、高效性狀的緊密配合，提高稻田產出效益需要高產、多抗、高效、優質性狀的全生產過程協同。近10年來，國審水稻品種中高產品種的比率一直保持在70%以上，國審水稻品種的總體優質比率達到49.9%，但抗性品種比率不到30%[45]。可見，在保持高產和優質的前提下，提升水稻品種的抗性是今后需要補齊的短板，我們創制的水稻耐逆境新種質將在提升水稻品種抗性中發揮重要作用。

值得特別指出的是，由于政策限制，轉基因性狀并不包含在現在的推廣水稻品種之中，一旦政策放開它們將釋放出巨大的紅利。例如，抗除草劑性狀方便除草，是直播栽培中急需的優異性狀，可以大幅度提高生產效率、降低成本；抗螟蟲性狀可以避免使用高毒或中毒農藥，將減少農藥成本和環境污染風險。此外，生產植酸酶-抗菌肽融合蛋白的水稻不僅能解決養殖業中存在的抗生素濫用和高磷糞便排放污染環境兩大難題，而且將大幅度提升水稻的附加值，具有誘人的應用前景。從當前實用的角度考慮，培育聚合多種耐逆境性狀的新種質、新品種將是今后要重點突破的主攻方向。從創新和引領的角度考慮，生產具有特殊功能蛋白質的分子農業將是未來要重點發展的新領域。