用BAC克隆技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠的注意要點有哪些？

答：細菌人工染色體(bacterial artificial chromosomes，BAC)是二十世紀九十年代發(fā)展起來的一種基因組文庫構(gòu)建技術(shù)，BAC載體遺傳穩(wěn)定性好，不易發(fā)生缺失和重組，且容易制備。BAC文庫已經(jīng)在人類基因組計劃和基因表達調(diào)控等研究領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用。BAC-DNA含有較大的基因組片段(～200 kb)、較全面的基因調(diào)控序列，且我們可通過Red重組技術(shù)對BAC-DNA實現(xiàn)定點修飾。BAC-DNA轉(zhuǎn)基因小鼠一個重要特點是它可以使轉(zhuǎn)入的外源基因在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)不依賴整合位點高效表達。因此使用BAC-DNA制備的轉(zhuǎn)基因小鼠在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中仍然具有一定的作用。在利用BAC-DNA制備轉(zhuǎn)基因小鼠時需要注意以下幾點：①BAC-DNA的制備需要特殊的質(zhì)粒試劑盒，推薦使用Nucleobond column方法提純(NucleoBond? BAC 100 kit)；②制備好的BAC-DNA盡可能進行脈沖場凝膠電泳，確定BAC-DNA的完整性；③注射緩沖液推薦加入Spermidine和Spermine(注射緩沖液：5 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4；0.2 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl)，以便能保存完整的BAC-DNA；④注射時可以使用環(huán)狀BAC-DNA，也可使用線性化BAC-DNA，但線性化BAC-DNA的純化過程比較復(fù)雜，相應(yīng)地增加技術(shù)難度；⑤注射時使用較粗口徑的注射針和較低的注射壓力。