蛇床子防治骨質(zhì)疏松的研究概況

廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530200

骨質(zhì)疏松癥是一種系統(tǒng)性的骨骼疾病，可分為原發(fā)性、繼發(fā)性以及特發(fā)性三種類型[1]。研究報(bào)道骨量和骨丟失是骨質(zhì)疏松兩種關(guān)鍵的決定因素[2]。當(dāng)骨吸收大于骨形成，造成密骨質(zhì)丟失、類骨質(zhì)增多，骨密度下降，就會造成骨質(zhì)疏松[3]。此外，還存在多種因素易造成骨質(zhì)疏松：①年齡增加，骨丟失會增大[4]；②性激素分泌下降。激素、雄激素和孕激素等促進(jìn)骨形成以及抑制骨吸收[5-6]。③細(xì)胞因子平衡失調(diào)。如促進(jìn)骨形成的轉(zhuǎn)化生長因子、胰島素樣生長因子(Insulin-like Growth Factor, IGF)以及護(hù)骨素及其配體促進(jìn)骨吸收的白細(xì)胞介素-1(Interleukin-1, lL-1)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子TNF失調(diào)等[7-8]。④長期服用激素也可能導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[9]。

骨質(zhì)疏松癥與中醫(yī)理論的“骨痿”病描述接近，《素問》曰：“腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿”[4]。因此，骨質(zhì)疏松癥與腎精關(guān)系較為緊密，《醫(yī)經(jīng)精義》曰：“骨者，腎之所合也。骨內(nèi)有髓，骨者，髓所生，腎藏精，精生髓，髓生骨”。又稱“髓者，精之所生也，精足則髓足，髓工在骨內(nèi)，髓足者則骨強(qiáng)”。骨質(zhì)疏松癥的中醫(yī)證型也與腎關(guān)系密切，主要是肝腎陰虛、脾腎陽虛、腎陰虛[10]。由此，中醫(yī)認(rèn)為腎虛不足是骨質(zhì)疏松的主要原因之一。

1 蛇床子的論述

中藥蛇床子又稱蛇米、蛇粟，是傘形科植物蛇床的干燥果實(shí)，味苦辛，性溫，入脾、腎二經(jīng)，具有溫腎陽功效[11]。我國大部分地區(qū)都產(chǎn)蛇床，河北、江蘇、浙江、山東為主產(chǎn)區(qū)。與蛇床同科屬的品種如興安蛇床、濱蛇床、堿蛇床等也混淆入藥，但是品質(zhì)不佳[11]。本草典籍記載，蛇床子功效與腎的關(guān)系密切，具有補(bǔ)腎的功效?！端幮郧杏谩酚涊d蛇床子可“辛苦性溫，入腎命而祛風(fēng)燥濕”；《本草備要》、《本草從新》認(rèn)為蛇床子“補(bǔ)腎命，去風(fēng)濕辛苦而溫。強(qiáng)陽益陰，補(bǔ)腎祛寒，祛風(fēng)燥濕”；《本草求真》中論述蛇床子“燥脾濕、燥腎、祛腎風(fēng)濕熱、補(bǔ)腎火”。因此，中醫(yī)理論認(rèn)為蛇床子有防治骨質(zhì)疏松的功效。

2 蛇床子防治骨質(zhì)疏松研究方法與模型

在動物模型的藥理學(xué)研究中，蛇床子防治骨質(zhì)疏松的研究常用三種方法或者模型：①直接給藥法[2]；②給予激素致骨質(zhì)疏松模型[9]；③給予其他藥物致骨質(zhì)疏松模型[3]；④去卵巢骨質(zhì)疏松模型[12]；⑤護(hù)骨素(Osteoprotegerin, OPG)基因敲除骨質(zhì)疏松模型[6]。直接給藥法是指直接給予幼齡小鼠或者大鼠藥物(蛇床子提取物以及單體蛇床子素、陽性對照藥物)，每天都給予蛇床子素，每個(gè)月測一次骨密度，3個(gè)月后處死檢測骨體積百分率、骨小梁厚度和骨小梁數(shù)量，血清骨鈣素，抗酒石酸性磷酸酶，鈣、磷等含量[2]。糖皮質(zhì)激素致骨質(zhì)疏松模型常用地塞米松、醋酸潑尼松造模，將大鼠分成溶媒對照組，模型組，陽性藥物組，蛇床子低中高劑量組，除了溶媒對照組，其他組別均給予激素，每周兩次給藥，每次1 mg/kg，8周后觀察各組骨礦化密度，檢測Ca2+、P3+、血清堿性磷酸酶、甲狀旁腺激素、雌二醇等含量，此法不用對動物模型進(jìn)行手術(shù)。其他藥物致骨質(zhì)疏松模型，例如維甲酸也被用到蛇床子防治骨質(zhì)疏松的研究動物建模[3]。去卵巢骨質(zhì)疏松模型與其他類型顯著不同在于去卵巢手術(shù)。因手術(shù)的原因，分組與激素造模略有不同，常分為手術(shù)造模組，蛇床子給藥組，激素(丹爾雌醇、乙烯雌酚、鹽酸雷洛昔芬等)陽性對照組以及假手術(shù)組[12]。臨床的研究一般直接觀察病人服用不同藥物的治療效果來判斷是否有效[5,13,14]。OPG基因敲除模型是一種新的模型，OPG是一種腫瘤壞死因子受體，它調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成，OPG基因敲除后，破骨細(xì)胞生成增多，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[6]。趙永見比較了蛇床子素對這個(gè)模型與去卵巢模型的作用[6]，這個(gè)模型不用手術(shù)，建模效果好，是一種較為理想動物模型。

3 蛇床子對骨質(zhì)疏松作用

在藥理學(xué)研究中，無論是動物模型建立過程中或者模型建立后給予蛇床子，蛇床子對骨質(zhì)疏松都具有防治作用。首先，蛇床子可增加骨長度、骨量以及骨密度[15]，大鼠口服蛇床子素或者蛇床子總黃酮后，骨密度顯著增加[2,16]。也有研究報(bào)道含蛇床子的健骨靈可提高體現(xiàn)骨密度的兩種骨成分——鈣、磷的濃度[17]。其次，蛇床子可以改善骨微結(jié)構(gòu)以及骨生物力學(xué)，提高抗骨折能力，研究報(bào)道蛇床子組的骨體積百分率、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量、股骨最大載荷、屈服強(qiáng)度和彈性模量都比對照組高，但骨小梁分離度顯著低于對照組[2]。趙永見等也觀察到蛇床子素能提高OPG基因敲除小鼠和去卵巢大鼠的骨小梁體積分?jǐn)?shù)，增加兩種動物模型的骨小梁數(shù)目和骨小梁厚度，降低骨小梁分離度，從而改善骨結(jié)構(gòu)[6]。再次，蛇床子還可抑制骨吸收。蛇床子素降低了抗酒石酸酸性磷酸酶濃度，抗酒石酸酸性磷酸酶濃度是骨吸收生化指標(biāo)之一，降低了抗酒石酸酸性磷酸酶濃度可抑制骨吸收[18]。有研究報(bào)道去卵巢骨質(zhì)疏松模型動物的血清降鈣素、TGF-β1的濃度下降，血清降鈣素、TGF-β1可抑制骨吸收，蛇床子可以提高去卵巢骨質(zhì)疏松模型動物的血清降鈣素以及TGF-β1[19]。此外，蛇床子促進(jìn)骨形成。成魁發(fā)現(xiàn)蛇床子素升高骨形成的骨鈣素濃度，骨鈣素可促進(jìn)骨形成[2]。蛇床子總香豆素或者蛇床子素有類1,25-(OH)2-D3作用或直接提高1,25-(OH)2-D3水平從而促進(jìn)成骨細(xì)胞合成和分泌骨鈣素[9]。堿性磷酸酶是骨形成與骨轉(zhuǎn)換另一重要指標(biāo)，大鼠去卵巢后，由于形成高轉(zhuǎn)換的骨質(zhì)疏松，因此堿性磷酸酶比正常組要高，有趣的是蛇床子降低堿性磷酸酶濃度又升高骨鈣素濃度，堿性磷酸酶降低提示降低高轉(zhuǎn)換，骨鈣素濃度升高則促使骨形成速度大于骨吸收，提高骨密度[20]。蛇床子總香豆素還提高血清IGF-1 濃度促進(jìn)骨形成。IGF-1是成骨細(xì)胞分泌的一種非膠原蛋白，可維持骨礦化速率，羅小玲報(bào)道蛇床子總香豆素組的IGF-1達(dá)到399.61 μg/L，比骨質(zhì)疏松模型組203.11 μg/L高不少。對于糖皮質(zhì)激素引起的動物骨質(zhì)疏松，蛇床子素降低糖皮質(zhì)激素引起的炎癥介質(zhì)IL-1分泌增多,來對抗IL-1所致的骨吸收[21]。最后，蛇床子可以刺激雌激素的增加，雌激素選擇性的抑制骨吸收，不抑制骨形成，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，抑制破骨細(xì)胞形成。鮑君杰認(rèn)為蛇床子素可能具有雌激素受體激動劑的作用，研究也發(fā)現(xiàn)蛇床子總香豆素或者蛇床子素可提高雌二醇的水平[12]。

4 蛇床子防治骨質(zhì)疏松的細(xì)胞機(jī)制

4.1 成骨細(xì)胞 在骨微環(huán)境中，參與骨重建的細(xì)胞主要是成骨細(xì)胞(Osteoblast, OB)和破骨細(xì)胞(Osteoclast, OC)。OB細(xì)胞是骨形成、骨代謝的主要功能單位。OB細(xì)胞能夠分泌膠原促進(jìn)鈣化，還可調(diào)控OC細(xì)胞的分化和成熟。蛇床子總香豆素或者蛇床子素對OB的增殖分化，OB分泌的細(xì)胞因子、OB相關(guān)的基因、酶以及成骨性分化因子等都有調(diào)節(jié)作用。

蛇床子對OB細(xì)胞的增殖與分化具有促進(jìn)作用。在早期的研究中，張巧艷等給予新生大鼠顱骨原代培養(yǎng)OB細(xì)胞蛇床子總香豆素或者蛇床子素，比陰性對照細(xì)胞增加達(dá)到81.8%，甚至比陽性對照藥依普黃酮的效果更好[22]，蛇床子骨靶向藥物也觀察相似結(jié)果[23]。但是，也有研究報(bào)道蛇床子素抑制原代成骨細(xì)胞的增殖，并且與濃度呈正相關(guān)。李玲慧檢測了與細(xì)胞增殖的活性肽PCNA，以及Wnt信號通路的β-catenin，發(fā)現(xiàn)蛇床子素既降低PCNA，又抑制β-catenin的表達(dá)[24]。而對成骨樣細(xì)胞系UMR106的研究，則認(rèn)為蛇床子醇提物或者蛇床子素促進(jìn)UMR106的增殖[25]。ALP是OB細(xì)胞分化早期的特異性標(biāo)志之一，蛇床子總香豆素或者蛇床子素能夠顯著促進(jìn)OB細(xì)胞的ALP[26]，這提示蛇床子促進(jìn)OB細(xì)胞的分化。因此，蛇床子素對于OB細(xì)胞增殖的作用還有待繼續(xù)深入研究。

蛇床子抑制OB細(xì)胞分泌的某些細(xì)胞因子，這些因子與OC細(xì)胞相關(guān)的。無論是蛇床子總香豆素還是蛇床子素都能降低OB細(xì)胞產(chǎn)生的NO，IL-1和IL-6濃度，抑制IL-6mRNA表達(dá)[8]。OB細(xì)胞分泌的NO、IL-1和IL-6對OC細(xì)胞的形成和分化具有調(diào)節(jié)作用。IL-1可促使OB細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，IL-6促進(jìn)OC細(xì)胞的前體細(xì)胞生長分化及成熟的OC細(xì)胞活化，從而促進(jìn)骨吸收。因此，蛇床子通過抑制NO、IL-1、和IL-6間接抑制OC細(xì)胞成熟，降低了骨吸收。還有研究報(bào)道蛇床子素可以促進(jìn)OB細(xì)胞骨OPG的分泌，OPG可以競爭性與核因子NF- κB受體活化因子配體( Receptor Activator of NF- κB ligand, RANKL)結(jié)合，并阻礙RANKL與OC細(xì)胞及其前體上的NF - κB受體活化因子(Receptor Activator of NF- κB, RANK) 結(jié)合。RANKL不能與RANK結(jié)合，OC細(xì)胞的活化將受到影響[27-28]。其他研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，床子素抑制RANKL，增大OPG/RANKL比值，抑制骨吸收的效果進(jìn)一步加強(qiáng)[23]。

蛇床子促進(jìn)OB細(xì)胞分泌成骨相關(guān)的細(xì)胞因子。首先，蛇床子可促進(jìn)或者刺激OB細(xì)胞分泌細(xì)胞基質(zhì)I型膠原[29]。其次，明磊國2011報(bào)道蛇床子素干預(yù)后，OB細(xì)胞分泌的骨鈣素顯著增加，骨鈣素能阻止OC細(xì)胞的分化，抑制成熟OC細(xì)胞的骨吸收活性和誘導(dǎo)OC細(xì)胞的凋亡[7]。此外，蛇床子素還上調(diào)分化因子COL-1、Runx-2、Osterix以及生長因子bFGF、IGF-I等的mRNA。蛇床子素干預(yù)組的COL-1、Runx-2蛋白表達(dá)也高于對照組，這些細(xì)胞因子都能促進(jìn)OB細(xì)胞的成熟分化[7]。有趣的是當(dāng)處理了OB細(xì)胞的纖毛，蛇床子素促OB細(xì)胞分化作用就會減弱[26]。但是它的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4.2 破骨細(xì)胞 蛇床子抑制OC細(xì)胞的成熟與分化，降低OC細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)OC細(xì)胞凋亡，并調(diào)節(jié)其骨吸收功能。首先，蛇床子總香豆素干預(yù)后，培養(yǎng)的OC細(xì)胞分化數(shù)量下降[30]。其次，秦路平等觀察到OC細(xì)胞在骨片上形成的吸收骨陷窩的面積可被25 mg/L蛇床子總香豆素減少25.05%，骨片中Ca2+的釋放減少41.73%[30]。其他研究也支持這一結(jié)果，明磊國等報(bào)道，蛇床子素干預(yù)效果更好，骨陷窩的數(shù)目比對照組少了50%，骨陷窩的面積僅為對照組的45%[18]。此外，25 mg/L的蛇床子總香豆素干預(yù)48 h后，OC細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶的活性降低了26.3%[18]。最后，蛇床子素使OC細(xì)胞的凋亡率升高，蛇床子素干預(yù)后OC細(xì)胞的凋亡率升高14%。蛇床子可能通過以下機(jī)制調(diào)節(jié)OC細(xì)胞功能：①調(diào)節(jié)與OC細(xì)胞相關(guān)的RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)基因，影響RANKL、OPG的表達(dá)，抑制OC細(xì)胞分化；②下調(diào)TRAP基因，抑制OC細(xì)胞活性；③抑制OC細(xì)胞JNK1/2 的磷酸化水平。

4.3 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是OB細(xì)胞來源，如果骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化成OB細(xì)胞機(jī)制出現(xiàn)障礙，會導(dǎo)致OB細(xì)胞數(shù)量下降或功能降低，因此，它在機(jī)體成骨活動中扮演重要角色。研究報(bào)道，蛇床子素干預(yù)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞堿性磷酸酶顯著增高[31]。但是，蛇床子素卻不促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖。此外，蛇床子素促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞釋放骨鈣素、鈣鹽沉積量增加。綜上，蛇床子素促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化并發(fā)揮其作用。

4.4 軟骨細(xì)胞 軟骨參與骨的發(fā)育，軟骨細(xì)胞的退變及礦化可促進(jìn)骨骼的形成。丁道芳報(bào)道高濃度蛇床子素抑制軟骨細(xì)胞的增殖[32]，蛇床子素可能通過抑制PCNA 和CyclinD1表達(dá)發(fā)揮抑制軟骨細(xì)胞增殖。

5 臨床應(yīng)用

臨床上，蛇床子多是在方劑中應(yīng)用于骨質(zhì)疏松的治療。張日松報(bào)道，含蛇床子的補(bǔ)腎壯骨湯治療絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松要比密蓋息要更好，連續(xù)服用180 d后，補(bǔ)腎壯骨湯治療組的骨密度顯著增加，雌激素水平增加，堿性磷酸酶下降[14]。另一臨床研究報(bào)道含蛇床子的骨保合劑不僅增加骨密度降低堿性磷酸酶下降，而且尿中鈣/肌酐比也下降[13]。上述研究并不能明確說明蛇床子的機(jī)制，僅觀察到含蛇床子的方劑效應(yīng)，因此，蛇床子在臨床上的研究還有待進(jìn)一步深入。

6 蛇床子抗骨質(zhì)疏松有效成分

蛇床子含有多種成分包括香豆素類、單萜多醇類、糖類、色原酮類、揮發(fā)油類，微量元素等。香豆素類成分已經(jīng)明確有防治骨質(zhì)疏松的效果，很多研究報(bào)道蛇床子總香豆素是有效成分[33]。蛇床子含有多種香豆素，包括：蛇床子素(osthole)，歐芹屬素乙(imperatorin)，異虎耳草素(isopimpinelline),佛手柑內(nèi)酯(bergapten)，花椒毒素(xanthotoxin)，花椒毒酚(xanthotoxol)，蛇床定(cnidiadin)，當(dāng)歸素(archangelich),白芷素(angelicin)，二氫山芹醇乙酸酯(O-acetyl-columbianetin)，哥倫比亞苷元(columbianetin)，歐山芹素(oroselone)，以及auraptenol，columbianadin，isogosferol和demethyl-auraptenol等[33]，目前研究報(bào)道只有蛇床子素等成分具有防治骨質(zhì)疏松的效用，未來，其他的香豆素防治效用的研究可能是蛇床子防治骨質(zhì)疏松的研究之一。此外，徐宏等研究報(bào)道蛇床子總黃酮可提高大鼠骨密度以及股骨力學(xué)指標(biāo)[16]。段旭紅則指出色原酮cnidimoside A、5-O-甲基維斯阿米醇、升麻素、5-羥基色原酮-7-O-β-葡萄糖苷等對類成骨細(xì)胞UMR106 的增殖有30%的促進(jìn)作用，這提示這幾種可能具有防治骨質(zhì)疏松的作用[34]。綜上，蛇床子防治骨質(zhì)疏松的有效成分研究還不夠明確，仍需進(jìn)一步深入探討。

7 小結(jié)

蛇床子是一味溫腎陽，防治骨質(zhì)疏松的中藥。它可以增強(qiáng)骨密度，通過對OB細(xì)胞、OC細(xì)胞，干細(xì)胞等作用，調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松。目前，對于中藥治療骨質(zhì)疏松的動物模型已經(jīng)穩(wěn)定成熟，也可以觀察很好的指標(biāo)與效果。在細(xì)胞水平，研究在一定程度上觀察到了對骨細(xì)胞的作用。但是蛇床子還有哪些成分參與抗骨質(zhì)疏松作用，蛇床子素具體與骨細(xì)胞膜上或者細(xì)胞內(nèi)哪些蛋白或者分子相互作用而引起相應(yīng)的反應(yīng)，這些都是蛇床子抗骨質(zhì)疏松未來的研究方向。