RT-PCR檢測豬繁殖障礙與呼吸道綜合征病毒方法的建立與應用

（江蘇農牧科技職業學院，江蘇泰州 225300）

1 前言

豬繁殖障礙與呼吸道綜合征，簡稱為PRRS，也可以稱之為藍耳病，發病后，往往會出現發熱、食欲減退、遲產、死產以及木乃伊胎等，如果是仔豬患病的話，往往會伴有明顯的呼吸道癥狀，從而導致死亡。如果能夠快速做出診斷，進而采取恰當措施進行治療的話，往往會取得理想的效果。由此可見，關于“RTPCR檢測豬繁殖障礙與呼吸道綜合征病毒方法的建立與應用”的研究與分析顯得尤為重要。

2 關于RT-PCR檢測豬繁殖障礙與呼吸道綜合征病毒方法建立與應用的研究與分析

2.1 概述

對于這種疾病，最為關鍵的就是要能夠快速做出診斷，這也是能否有效防治這種疾病的關鍵所在。PCR技術的原理在于通過對體內DNA的復制過程，實現基因的體外擴增，而檢測迅速、特異性強、敏感性好、操作簡單、產量理想等都是最為顯著的特點，相對于傳統的方法，這種檢測方法更加迅速、直觀。

2.2 具體方法

2.2.1 材料

所需要用到的材料主要就是酶類及其制劑以及相關的儀器設備等。

2.2.2 方法

方法主要包括引物的設計、病毒核酸的提取以及合成、反應條件范圍的確定和產物的確定等。

第一就是引物的設計，主要是要考慮到PCR的實際要求，設計檢測PRRSV引物，并將其進行定名，分貝是上游引物和下游引物。

第二步就是提取病毒核酸，主要包括血液樣品的提取、組織樣品RNA的提取以及公豬精液樣品RNA的提取。

第三步就是PRRSV病毒cDNA的合成，具體來說就是首先要完成試劑的配制，操作是在PCR管中完成的；緊接著就是在70℃的條件下，在PCR儀器中進行保溫處理，處理的時間大約是10min，之后就要迅速進行急冷處理，時間大約兩分鐘；第三個步驟就是講上述已經制成的液體混合均勻后，進行離心處理，主要目的就是為了讓混合液能夠在管底聚集；第四個步驟就是配制反應液，同樣是需要在PCR管中完成的。在配制的實際過程中，需要注意的是，配制一定要在冰盒上進行，而且需要佩戴一次性手套，以免造成酶污染。

第四步就是建立PRRSV的RT-PCR方法，在這個步驟中，PCR的擴增程序可以簡單概括為：在94℃的條件下預變性，時間為五分鐘；在94℃的條件下，變性，時間為30s；在59℃的條件下進行退火操作，時間為30s；在72℃的條件下進行延伸處理，時間是30s；之后就是33個循環；在72℃的條件下進行延伸處理，時間是5min。等到循環完成了之后，將PCR的產物5提取出來，用濃度是1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳處理，對擴增的結果進行觀察。

第五步就是反應條件范圍的群定，主要是引物的濃度確定、dNTPs濃度的確定、RTaq酶濃度的確定以及被檢測樣品質量對RT-PCR檢測的影響以RT-PCR退火溫度的確定以及模板量的確定等。

第六步就是對RT-PCR的產物進行鑒定，鑒定的過程主要主要是分為以下幾個步驟，分別是PCR產物的電泳與回收純化處理；PCR產物的連接以及轉化、搖菌、質粒的提取和酶切的鑒定，等到上述工作完成之后，進行測序處理。

2.3 關于結果

2.3.1 引物

這個實驗設計的主要目的就是為了設計出PRRSV檢測引物，然后分別在兩端進行限制性酶切位點的添加。

2.3.2 RT-PCR反應條件范圍的確定

第一，關于引物的濃度，對于PRRSV來說，RT-PCR反應最為適宜的引物添加量應該是0.5μl。

第二，就是要確定dNTPs的濃度，對于PRRSV來說，RT-PCR反應最為適宜的dNTPs添加量是1μl。

第三，就是要確定R Taq酶濃度，對于PRRSV來說，RT-PCR反應最為適宜的R Taq添加量是0.5μl。

第四，關于被檢測樣片質量對RT-PCR檢測的影響，通過這個實驗，對陳舊的被檢測樣品和新鮮的被檢測樣品在RT-PCR檢測中的差異進行分析，得到如下結論，相對于新鮮的被檢測樣品而言，從陳舊的被檢測樣品中提出獲得的RNA更容易降解，而且電泳的效果也比較差。這就是說，無論是在進行RT-PCR檢測方法建立的實驗中，還是在實際的應用過程中，都要確保被檢測樣品的新鮮，從而保證檢測結果的準確率。

第五，確定單相RT-PCR的退火溫度，我們以PRRSV為例子進行說明，分別在53℃、55℃和59℃的退火溫度下進行試驗，結果表明，59℃的退火溫度條件下，PCR產物的特異性更加理想。

2.3.3 鑒定RT-PCR產物

通過目的片段與PMD-18T的連接、轉化、涂板和挑菌四管，提取質粒，結果發現，四個質粒都有酶切目的片段370bp，可以任選一管送去測序，對于測序的結果進行比對之后完全符合。

3 結語

豬繁殖障礙與呼吸道綜合征不僅僅會對免疫系統造成侵害，而且所導致的感染也是持續性的，再加上預防起來比較困難，因此這種疾病逐漸成為制約養豬業發展的重要因素。雖然目前關于這種疾病已經研究出了多種檢測和診斷的技術，但是相對于間接免疫熒光、原位雜交以及免疫組化等，RT-PCR檢測技術更加省時，操作更加簡單，結果更加準確，因此也就更加值得推廣。

[1] 涂宜強，楊增歧，徐輝.RT—PCR檢測豬繁殖障礙與呼吸道綜合征病毒方法的建立與應用[J]. 中國畜牧獸醫，2005，32（6）：52-53.