臭氧在中晚期原發性肝癌的應用探索

張潔，付海艷，羅煜

昆明市第三人民醫院姑息治療科，云南昆明 650041

臭氧(Ozone)也稱三氧，是氧氣的同素異形體，由三個氧原子組成，是一種強氧化劑，常溫下半衰期約20 min，易分解，易溶于水。臭氧屬于有害氣體，濃度為0.3 mg/L時，對眼、鼻、喉有刺激的感覺，濃度3～30 mg/L時，出現頭疼及呼吸器官局部麻痹癥狀，濃度15～60 mg/L時，對人體有害。自1958年濃度劑量可調控的臭氧發生器誕生后，臭氧在醫學領域得到了廣泛的應用。在適當劑量（0.3～0.5 ppm）下，臭氧對癌細胞起劑量依賴性的生長抑制作用，且在適當劑量范圍內對人體正常細胞無明顯損害。臭氧可誘導腫瘤壞死，抑制腫瘤細胞增殖。在缺氧環境下，缺氧誘導因子1A（HIF1A）可調節基因轉錄介導機體適應性反應。低氧環境下胞核HIF-1A表達明顯增高，臭氧治療可抑制HIF-1A水平，從而在慢性損傷等疾病中發揮治療作用。

1 肝癌的流行病學現狀

根據2012年全球癌癥統計數據[1]，肝癌居全球癌癥死亡原因第三位，發病數居第五位，而在發展中國家，其發病數及死亡數均居男性癌癥患者第二位。僅2012年，全球有大約78萬新增肝癌患者，約74萬因肝癌致死，其中，新發及死亡病例中，中國均占了50%左右。根據云南省疾病控制中心的調查[2]，肝癌高居云南省惡性腫瘤死亡病例第二位。我國原發性肝癌患者多數有病毒性肝炎（多為乙型肝炎）背景，因此，其肝功能儲備較差，相當部分患者無法進行手術治療，且原發性肝癌70%～90%病理類型為肝細胞癌，對放化療均不敏感。因此，在中晚期原發性肝癌患者中，如何在肝功能保護的同時尋找合適的治療方法以緩解患者癥狀、提高生活質量仍是值得臨床關注的問題。

2 臭氧抗炎、抗病毒的研究

臭氧在病毒性肝炎、肝硬化及急性肝損傷的臨床及實驗研究表明，臭氧對肝功能有一定的改善作用。Zaky等[3]應用臭氧自體血回輸/微量自體血回輸/直腸注氣聯合治療慢性丙肝患者，研究共納入52名慢性丙肝患者，其中40名患者采用臭氧聯合療法，12名患者采用傳統治療（水飛薊素及復合維生素）。結果顯示ALT/AST正常率及HCV RNA轉陰率均顯著高于對照治療組。郭亞兵等[4]回顧了2005-2014年應用臭氧治療肝炎的臨床研究，結果顯示從慢性乙（丙）型肝炎、肝硬化和肝衰竭不同肝病類型及階段，臭氧療法均顯示出抗病毒、抗炎護肝及改善癥狀的效果，且治療耐受性良好。Zaky的研究團隊[5]納入15名肝硬化患者，給予臭氧（300 mL濃度為40%臭氧/純氧混合氣體，療程為12次）直腸注氣治療，治療前及末次治療后半小時分別在超聲指引下取門靜脈血，測量門靜脈氧分壓及飽和度，結果顯示臭氧直腸注氣治療可顯著提高門靜脈氧合水平。這一結果可能在一定程度上解釋了臭氧直腸注氣治療對肝功能改善的機制。

3 缺氧誘導腫瘤細胞的增殖

氧穩態是腫瘤進化、發展的生理基礎[6]。缺氧在腫瘤發展及轉移中的作用日益得到重視。臭氧可以為腫瘤內提供充足的氧分壓，在癌癥發生部位提供足夠的氧抑制腫瘤生成及惡性度增加，達到細胞水平上抑制癌細胞的生長。在缺氧環境下，缺氧誘導因子1A（Hypoxia-inducible factor 1A,HIF1A）可調節基因轉錄介導機體適應性反應。HIF1A已被證實是促紅細胞生成素（調節紅細胞生成）、血管內皮生長因子（VEGF，促血管生成）及糖酵解酶等多種基因的調節因子，從而調節腫瘤缺氧微環境的適應性細胞代謝[7]。既往已有多個研究[8-9]顯示臭氧治療可抑制HIF-1A水平，從而在糖尿病腎病、軟組織損傷等疾病中發揮治療作用。來自西班牙的Clavo團隊[10]納入18例晚期惡性腫瘤患者，應用臭氧自體血回輸進行治療，測定腫瘤氧合情況。結果顯示，臭氧治療后患者低氧指數（PO2≤10 mmHg或5 mmHg比例）明顯降低，且氧合增加與腫瘤初始PO2值呈明顯非線性負相關，提示缺氧越嚴重的腫瘤，臭氧治療獲益越明顯。Bowyer等人[11]在常氧及低氧環境下將HepG2細胞與阿霉素/雷帕霉素/二者聯合應用分別培養，結果顯示低氧環境下HepG2細胞對藥物抵抗力明顯增強。Western-blot結果顯示低氧環境下胞核HIF-1A表達明顯增高，有效劑量的阿霉素/雷帕霉素均可顯著抑制胞核HIF-1A表達，提示低氧在肝癌發展及化療抵抗起重要作用，針對低氧及HIF-1A的治療可能是肝癌治療的重要方向。低氧環境可促進腫瘤細胞的生長。臭氧清除腫瘤放化療過程中形成的自由基，消滅殘留的腫瘤細胞，增加局部氧飽和度，增強腫瘤對放化療的敏感性。

4 臭氧對癌細胞的抑制

早在1980年，來自美國華盛頓大學的Sweet等人[12]在science雜志上發表的研究顯示將臭氧與人肺泡腺癌細胞、乳腺癌細胞、子宮肉瘤細胞及子宮內膜癌細胞共培養，在適當劑量（0.3-0.5ppm）下，臭氧對癌細胞起劑量依賴性的生長抑制作用，且該劑量范圍內，臭氧對對照細胞（二倍體成纖維細胞）無抑制作用。增加劑量至0.8 ppm，癌細胞生長抑制超過90%，而對照組細胞抑制仍不到50%。表明臭氧對人類癌細胞可有劑量依賴生長抑制作用，且在適當劑量范圍內對人體正常細胞無明顯損害。Schulz等人[13]的研究制作VX2頭頸部鱗狀細胞癌新西蘭兔動物模型，分別予臭氧/純氧混合氣體，純氧及對照治療，結果顯示臭氧/純氧混合氣體腹腔注氣組14只實驗兔存活7只，其中6只腫瘤完全消失且未見局部及遠處肺轉移。純氧治療組13只實驗兔存活3只，2只腫瘤完全消失。對照組14只實驗兔僅1只存活。且研究發現臭氧/純氧混合氣體治療組中腫瘤消失的實驗兔對VX2再植入可產生抗性。Kuroda的研究團隊將臭氧水應用于荷瘤小鼠局部，結果發現臭氧水局部應用對正常臟器功能無影響；與對照組相比，臭氧水局部應用組腫瘤壞死面積明顯增大，且具有劑量依賴性[14]。周玉川等人[15]研究方法為獲取人肝癌HepG2細胞在體外增殖、傳代、對數生長期的細胞，實驗組采用含濃度為0.5μg/ml的醫用臭氧水的培養液處理細胞，觀察細胞生長曲線、細胞凋亡情況、細胞遷移能力變化。結果體外實驗結果顯示，含臭氧的培養基中細胞數量明顯減少，腫瘤細胞膜破裂，核固縮甚至裂解，臭氧對細胞的生長有抑制作用，同時CCK-8的檢測結果顯示臭氧能抑制肝癌細胞的增殖，Transwell遷移實驗顯示臭氧能抑制腫瘤細胞的遷移。Kuroda的研究團隊將臭氧水應用于荷瘤小鼠局部，結果發現臭氧水局部應用對正常臟器功能無影響；與對照組相比，臭氧水局部應用組腫瘤壞死面積明顯增大，且具有劑量依賴性[14]。提示臭氧水可誘導腫瘤壞死，抑制腫瘤細胞增殖。基于以上研究，我科前期研究[16]，以臭氧水腹腔灌注治療癌性腹腔積液及晚期腫瘤患者，結果顯示臭氧水可抑制惡性腹水的生長。

在歐洲，臭氧早已應用于腰椎間盤突出、關節炎、肩周炎疾病，創傷及難治性潰瘍，抗自由基防衰老、中風及病毒性肝炎等疾病的治療，其臨床療效得到了充分肯定。在醫學發展的今天，逐漸研究出將更純濃度的醫用臭氧和不同的載體結合，形成臭氧水，臭氧自體回輸血和臭氧氣體的直接運用，臭氧可以在體內發揮其強氧化性。中晚期原發性肝癌多由慢性病毒性肝炎，肝硬化逐步發展而來。中晚期肝癌常常不同程度伴有惡性腹水形成。臭氧針對人體機體慢性缺氧，在有限的組織血液中提高氧濃度的作用，直接抑制和殺滅細菌、病毒，延緩腫瘤的發展，抑制腫瘤細胞的生長。因此，臭氧的治療在中晚期原發性肝癌的治療中有廣泛的臨床運用前景。